中国狂犬病毒疫苗株CTN-1-V三个代次的GP基因序列分析

目的分析三个代次CTN-1-V病毒株糖蛋白(GP)基因部分序列,并与代表性街毒株进行比较。方法利用RTPCR反应,从感染了CTN-1-V病毒的小鼠脑内获得GPcDNA的部分片段,并进行序列测定。结果三个代次的CTN-1-V病毒株GPcDNA序列的690个核苷酸与代表性狂犬病毒GP核苷酸相应序列同源性为83.2%～96.8%,氨基酸序列同源性为90.0%～97.4%。CTN1V株三代之间的核苷酸序列几乎相同。结论CTN1V株在传代过程中GP基因结构基本稳定,与中国流行的代表性街毒株的同源性高于aG株和PV株。     

我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析

目的测定我国人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白G基因序列,并对其进行生物信息学分析。方法 RT-PCR扩增3株病毒糖蛋白G基因,分别克隆至pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,进行测序。应用DNAstar MegAlign软件分析3株病毒糖蛋白的同源性,AntheProt 5.0及DNAstar Protean软件分析3株病毒糖蛋白的结构及潜在B细胞抗原表位的差异。结果 4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒均属基因Ⅰ型狂犬病病毒;其糖蛋白G区基因同源性为76.0%～88.4%,G区ORF基因同源性为84.4%～91.5%,氨基酸序列同源性为90.5%～92.2%;3株病毒糖蛋白前19位氨基酸中均存在潜在信号肽结构,其中第19位氨基酸为三者潜在信号肽断裂位点,第17位氨基酸为4aGV株病毒糖蛋白潜在信号肽断裂位点;3株病毒糖蛋白分别在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潜在可折叠螺旋的疏水性区域,为明显跨膜区域;4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸残基均富含潜在α螺旋、β折叠及卷曲结构,其比例分别为30%、31%、39%,28%、30%、41%和29%、30%、41%,易发生扭曲、折叠,形成丰富的二级结构;3株病毒糖蛋白潜在B细胞抗原表位位置与数量相似。结论已对3株人用狂犬病疫苗株G基因进行了全面生物信息学分析,为完善我国人用狂犬病疫苗生产用毒种的质控标准提供了支持。     

新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析

目的分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况。方法采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较。结果5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列。与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间。将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间。3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间。将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%。结论新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

埃可病毒9型分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征

目的分析2010年昆明市引起手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原埃可病毒9型(Echovirus 9,E9)分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征。方法分别采用RD细胞和Hep-2细胞对3份HFMD患儿粪便标本进行病毒分离,应用RT-PCR法分2段扩增病毒VP1基因,并进行序列测定。应用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行比对;Omiga软件对所测定的节段序列的核苷酸及推导的氨基酸序列进行编辑、比对和拼接;应用Mega 5.05软件进行序列分析,并与15个E9参考株的VP1基因序列进行比较,构建基因系统进化树。结果从3份HFMD患儿粪便标本中分离到1株E9,命名为MSH-KM812,其VP1区的核苷酸长度为888 bp。MSH-KM812株与其他15个E9参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.6%～98.0%和87.5%～99.3%,与中国分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.7%～98.0%和97.0%～99.3%,其中与中国江苏分离株M10MF37 China2010核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为98.0%和99.3%,而与德国分离株Hill的核苷酸和氨基酸序列同源性最低,分别为78.6%和87.5%。基因进化树分析显示,MSH-KM812分离株与中国江苏分离株M10MF37 China 2010和中国山东分离株05189-SD-CHN-2005-E9属于同一个进化分枝。结论 MSH-KM812分离株为E9,与中国其他分离株同属一个进化分枝。     

2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因。PCR产物直接测序后,采用Omiga和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析。结果共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7%～98.5%和93.6%～100.0%;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1%～99.1%,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低;与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4%～100.0%,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性最低;与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5%～89.1%和92.1%～96.3%之间;与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%～80.9%和92.1%～95.4%。基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝。结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型。     

我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。     

H_5N_1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及分子进化分析

目的　克隆H5N1 亚型禽流感病毒HA基因并进行分子进化分析。方法　应用RT PCR方法 ,以 2株H5N1 亚型禽流感病毒RNA为模板 ,扩增了HA全基因cDNA。将HAcDNA基因克隆于pUCm T载体 ,并对其进行了测序。结果　所克隆的HA基因全长为 1731bp ,共编码 5 6 8个氨基酸。将该毒株与其它 10株H5亚型禽流感病毒HA基因序列核苷酸及氨基酸进行比较 ,其核苷酸同源性在 80 5 %～ 99 2 %之间 ,氨基酸序列同源性在 89 4 %～98 6 %之间。高致病性毒株HA基因裂解位点存在多个碱性氨基酸插入。结论　为禽流感基因工程疫苗的研制奠定了基础 ,同时通过分子进化分析也揭示了各毒株间的亲缘关系。     

肠道病毒71型甘肃分离株VP1基因特征分析

目的分析肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)甘肃分离株VP1基因的特征。方法应用RT-PCR法扩增4株EV71甘肃分离株(46F、47F、51F和55F)的VP1基因,克隆入pTA2载体,进行核苷酸序列测定,并进行序列的同源性比较及进化树分析。结果 4株病毒VP1核苷酸序列长度均为891bp,推导的氨基酸序列含297个氨基酸。51F与55F毒株核苷酸和氨基酸同源性均为100%,46F与47F的同源性分别为99.6%和99.0%,4株病毒与EV71的C4亚型毒株核苷酸同源性在96%以上,氨基酸同源性在99%以上。同源性和进化树分析显示,4株分离株分属2个群,其中51F和55F毒株同属一个群,其与昆明分离株kunming41-08亲缘关系最为相近;46F和47F同属一个群,其与内蒙分离株0723F/NM/CHN/07关系最为相近。结论 4株EV71甘肃分离株属于C4亚型,为中国EV71的基因分型、分子流行病学研究提供了参考。     

肾综合征出血热病毒PS-6株全基因组序列分析

目的分析肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫苗用PS-6毒株的分子基础和遗传背景,从分子生物学角度确认分型。方法 PCR法扩增PS-6毒株的L、M、S片段并进行序列测定,对获得序列进行拼接及序列分析。结果 PS-6株全基因组L片段由6 533个核苷酸组成,编码2 152个氨基酸;M片段由3 617个核苷酸组成,编码1 136个氨基酸;S片段由1 702个核苷酸组成,编码430个氨基酸。PS-6毒株3个片段与Ⅰ型病毒的同源性为83%～99%,与Ⅱ型病毒的同源性为70%。结论从分子生物学角度证明疫苗用PS-6毒株为Ⅰ型出血热病毒,为进一步研究该疫苗株的基因组结构、生物学特性、免疫原性及基因工程疫苗的研制奠定了理论基础。     

狂犬病病毒4aG株G蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

目的克隆狂犬病病毒(Rabies virus,RV)4aG株G蛋白基因,并与其他疫苗毒株G蛋白基因序列进行比较,为我国狂犬病疫苗的研制提供理论依据。方法从RV 4aG株中扩增G蛋白基因,并进行序列测定,利用生物信息学软件绘制系统进化树,预测G蛋白功能位点、二级结构和B细胞抗原表位,并与其他疫苗毒株进行比较。结果克隆的4aG株G蛋白基因序列与GenBank中登录的序列一致。进化树分析显示,4aG株与CVS株的进化关系较远;4aG、4aGV18、CVS、PV及RC-HL毒株跨膜区域在第460～479氨基酸之间,其他毒株在459～478氨基酸之间;PV株有5个糖基化位点,RV-97株有3个糖基化位点,其他毒株均有4个糖基化位点;G蛋白抗原表位位于氨基酸100～300及480～520之间;不同毒株G蛋白抗原位点区域有所不同,与CVS株比较,PV株抗原表位与其最为接近,4aG、4aGV18、CTN-1-31及Flury-HEP株与其抗原表位较为接近。结论4aG株G蛋白功能位点和抗原表位与CVS株相差较大,但其在Vero细胞上传代稳定,可用于制备Vero细胞纯化疫苗。     

3种传代细胞系对狂犬病病毒CTN-1V株敏感性的比较

目的比较3种传代细胞系(Vero细胞、BHK-21细胞、MDCK细胞)对狂犬病病毒CTN-1V株的敏感性。方法采用混种的方法,将狂犬病病毒CTN-1V株分别接种于上述3种不同来源的连续传代细胞系,在不同时间观察3种细胞的病变情况,同时应用快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)和ELISA法检测病毒滴度和抗原含量,分析不同来源细胞对狂犬病病毒CTN-1V株的敏感性。结果Vero细胞培养的狂犬病病毒滴度在第8天达到高峰,为7.80LogFFD50/ml,BHK-21细胞病毒滴度在第6天达到高峰,为7.30LogFFD50/ml,而MDCK细胞在第6天病毒最高滴度只有5.55LogFFD50/ml。BHK-21细胞培养的狂犬病病毒抗原含量(A492)值,在各代次均高于Vero细胞和MDCK细胞。结论Vero细胞和BHK-21细胞对狂犬病病毒CTN-1V株的敏感性高于MDCK细胞,且BHK-21细胞产毒高峰比Vero细胞提前。     

狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性

目的评价狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性。方法用不同病毒滴度的CTN-181株病毒对小鼠分别进行口腔或肌肉免疫,14 d后,分别用狂犬病病毒CVS株进行脑内或肌内攻毒,14 d后,计算小鼠的免疫保护力;同时于免疫后14、21和30 d,采用RFFIT法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体水平。结果两种途径免疫的小鼠均产生了较强的保护作用和较高的中和抗体水平。口腔免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×105和1.4×104PFU/ml;肌肉免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×106和1.4×105PFU/ml。小鼠口腔免疫CTN-181病毒量≥1.4×105PFU/ml 14 d后,即可产生有效的保护,至30 d时,1.4×106和1.4×107PFU/ml剂量组中和抗体水平达20 IU/ml以上;肌内免疫产生的中和抗体水平较低。结论 CTN-181减毒株具有良好的免疫原性,以较低病毒量免疫小鼠即可产生高水平的中和抗体和保护作用。     

狂犬病毒在Vero细胞上的传代适应

本文研究了3株狂犬病毒(C_(42)、C_(103)及4aG株)在Vero细胞上的培养条件和方法,并通过连续传代培养,选出1株滴度平均达到7.13LogLD_(50)/ml以上,达到WHO规定的不需浓缩的标准(≥10~(7.0)ICLD_(50)/ml)毒株—C_(42)—V_(170)病毒的增殖高峰由原来的10天左右提前到3～5天。另外2株的病毒滴度也达到了WHO规定的制备人用Vero细胞狂犬疫苗(PVRV)的标准(≥10~(6.0)ICLD_(50)/ml)。3株病毒都能在Vero细胞上产生蚀斑,符合WHO提出的疫苗生产毒种的要求。     

传染性法氏囊病病毒疫苗B87株基因组B节段的克隆和序列分析

目的获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)疫苗B87株B节段全长cDNA,并对其序列进行分析,为进一步在分子水平上研究病毒基因组的功能、抗原变异和毒力变异奠定基础。方法使用蛋白酶K和酚/氯仿抽提法提取病毒基因组RNA,用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA,通过RT-PCR一步扩增获得B节段的全长cDNA。将其克隆到pGEM-T载体上,然后测序,并用DNAStar软件进行序列分析。结果测序结果表明,克隆的B87株基因组B节段全长为2827bp,与超强毒参考株UK661和HK46的同源性分别为89.8%和89.3%,与强毒参考株Harbin-1和ZJ2000的同源性分别为90.2%和89.5%;与变异毒株GLS的同源性为97.8%;与弱毒参考株CEF94和Gt株的同源性均为99.8%,与P2株的同源性达100%。结论通过对9株IBDV编码氨基酸序列进行分析、比较,推测B节段上10个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。     

轮状病毒LLR疫苗株VP7基因的遗传变异研究

目的研究轮状病毒(RV)LLR疫苗株VP7基因的遗传特征,为疫苗的质量控制和发展提供依据。方法将LLR株轮状病毒毒种LLR38在原代牛肾细胞上连续传至49代。提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR扩增VP7基因片段,将其克隆入质粒pGEM-T中,进行序列测定与分析。结果LLR株VP7基因全长1062bp,含编码326个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)。各代次病毒的VP7基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与GenBanK中LLR参考株(L11602)同源性分别为99.9%和99.7%。与14株G10血清型RV毒株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.3%～87.4%和92.7%～94.9%;与不同血清型RV代表株间,VP7基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为62.2%～76.8%和72.9%～83.1%;在A、B、C3个重要抗原表位,LLR株与同一血清型RV代表株B223氨基酸同源性高达97.5%,而与不同血清型仅为42.5%～62.5%。结论轮状病毒LLR疫苗株VP7基因具有良好的遗传稳定性,与来自不同国家同一型别的RV株VP7蛋白氨基酸序列之间无明显差异,在遗传上密切相关,从VP7基因分子水平证明LLR株毒种及其制备的疫苗是安全可靠的。     

传染性法氏囊病病毒疫苗株B87基因组A节段的克隆和序列分析

目的获得传染性法氏囊病病毒疫苗株B87 A节段全长cDNA,并对其进行序列分析。方法使用蛋白酶K、酚/氯仿抽提法提取病毒基因组,用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA,通过RT-PCR一步扩增获得A节段的全长cD-NA。将其克隆至pGEM-T载体上,测序,并用DNAStar软件进行序列分析。结果测序结果表明,克隆的B87株A节段全长为3 260 bp,与Gt株的同源性最高为99.5%,与其他毒株的核苷酸同源性介于95.2%~99.4%之间,与Ⅱ型毒株OH仅为84.0%。结论通过对20株IBDV编码氨基酸序列的分析、比较,推测A片段上7个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。     

我国狂犬病流行毒株JX08-45适应细胞培养后的生物学特性

目的鉴定我国狂犬病流行毒株JX08-45适应细胞培养后(命名为JX08-45CC株)的生物学特性。方法通过全基因组序列分析比对、小鼠脑内和外周攻毒试验和免疫原性试验,分别对JX08-45CC株的基因组特点、毒力和免疫原性进行鉴定。结果 JX08-45CC株的基因组序列与JX08-45株比对,共出现16个核苷酸突变点和7个氨基酸突变点,其中6个氨基酸变异发生在G蛋白(333位精氨酸未改变)编码区,L蛋白仅有1个氨基酸突变;在G蛋白氨基酸变异中,4个突变序列在其他细胞适应毒株CVS-11、CTN-1、Nishigahara、SAG2、Flury-LEP和SRV9中也普遍存在。JX08-45CC株培养滴度≥107TCID50/ml时,脑内接种小鼠的致死率为100%,滴度为102～106TCID50/ml时,脑内接种小鼠的致死率为20%～80%;滴度为105～108TCID50/ml时,外周肌肉接种小鼠,致死率为10%～70%;脑内和外周攻毒小鼠的潜伏期均为7～9 d,并于发病后24～48 h死亡。JX08-45CC株与狂犬病病毒CVS-11、ERA、SRV9和Flury-LEP株的中和抗体滴度差异均无统计学意义(P>0.05)。结论已对JX08-45CC株的基因组序列、毒力和免疫原性等生物学特性进行了鉴定,为开发具有我国自主知识产权的兽用狂犬病灭活疫苗候选株奠定了基础。