骨髓活检组织超薄切片及细胞化学技术的研究

本文对骨髓异常增生综合症患者的骨髓活检组织,作了环氧树酯包埋前染色的电镜观察,现将此技术方法的初步体会报导如下:取材用骨髓活检针钻取髂后上嵴骨髓组织(5mm×1mm)一块,迅速投入1％戊二醛内(用0.1M二甲胂酸缓冲液pH7.2～7.4配制)。固定将活检组织切成1mm×1mm小块,再放入1.0％戊二醛内固定15分钟,同上的缓冲液清洗3次,每次10分钟。标本分作2份,1份用2.5％的戊二醛继续固定2小时,同上的缓冲液清洗3次后,再用1％O_sO_4(0.2M二甲胂酸缓冲液配制)固定1小时,留作常规超微结构标本制备用。另一份放入0.1M二甲胂酸缓冲液内留作     

急性砷中毒大鼠心肌的电镜细胞化学观察

本实验是把显示葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)的电镜细胞化学技术应用于研究急性砷中毒大鼠心肌G-6-Pase活性的变化,目的在于从亚显微水平上进一步探讨砷对心肌结构和功能的影响。选用健康wistar大鼠20只,随机分成实验组和对照组,每组10只。实验组大鼠每天自由饮用含As_2O_350PPm的蒸馏水,对照组饮用蒸馏水。35天后急性处死取其心尖部组织,置于4％多聚甲醛+1％戊二醛内前固定,入孵育液,37℃下孵育60min,1％锇酸后固定,常规脱水包埋,超薄切片,不经电子染色进行电镜观察。     

在中性领域,P-NPP酶活性检出方法中几种铅盐的效果比较

为了探索在中性环境中P—NPP酶活性的检出方法,对作为捕捉剂的铅盐种类进行了对比和选择。实验动物为体重35—40g的ddy系小白鼠。方法:用含20％多聚甲醛和0.5％戊二醛的固定液灌流固定10分钟,取出肾脏,做20—40μm厚的未冻切片,分别投入下面五组反应液中,37℃,浸渍30分钟。反应液的组成为:Tricine-NaOH缓冲液2.5mM,pH7.4;p-NPP10mμ;KC150mμ;levamisole2.5mμ;DMSD25％;再各个加入柠檬酸铅、硝酸铅、硫酸铅、氯化铅、醋酸铅4mμ。反应后,光镜用1％硫化铵液浸1—2分钟,电镜则用1％OsO_4后固定。再进行常规处理、分别用光镜和透视电镜观察、照像。     

培养的肺动脉内皮细胞的免疫和细胞化学鉴定

本实验用间接免疫荧光法和电镜免疫胶金法显示培养细胞的胞内凝血Ⅷ因子相关抗原(ⅧR:Ag)反应阳性以及电镜下Weible-Palade(WP)小体存在,证明所分离并经多次传代的细胞为内皮细胞。材料和方法:1.从新生小牛肺动脉中以胶原酶消化法分离出内皮细胞,于199培养液中培养并传代,取第3-5代细胞。实验前细胞培养于涂有鼠尾胶原的载玻片上。2.WP小体检测:细胞以PBS(0.1M,pH=7.4)原位漂洗并分别以3％戊二醛45分钟、1％锇酸30分钟固定;将预聚好的Epon812块扣于经脱水和Epon812浸透的细胞单层上,聚合后用热烤法将细胞层剥离于载玻片,常规超薄切片和铅铀染色,透射电镜下观察。3.ⅧR:Ag检测:(1)间接免疫荧光法:以95％4℃乙醇原位固定细胞10分钟,     

脊髓前角运动神经元GR受体免疫电镜观察

近年肾上腺皮质激素的糖皮质激素受体 ( Glucocorticoid receptor.GR)在脑神经细胞分布与作用的研究已倍受关注[1] ,脊髓 GR受体的分布尚未见报道 ,本研究采用免疫组织细胞化学方法对 GR受体在脊髓前角运动神经元的超微结构定位进行了电镜观察 ,为进一步探讨 GR受体对脊髓功能的作用机制提供形态学依据。材料与方法　实验动物为成熟 Wistar大鼠 (体重 2 5 0～ 30 0 g) ,全身麻醉下 ,用 4%多聚甲醛( 0 .1 mol/ L PBS缓冲液配制 )固定液心脏灌流固定 ,摘出脊髓 ,用同种固定液再继续浸泡固定一夜 ,同上缓冲液洗净标本 ,采用 microslicer(…     

心肌线粒体细胞色素氧化酶的图象分析

成年大鼠10只,随机分为实验组(6只)和正常对照组(4只)。实验组大鼠置入密封玻璃容器内,同时放人适量钠石灰。90分钟后,取出动物,麻醉后灌流固定,取左心室前外侧壁组织标本作超微细胞色素氧化酶反应,同时取正常对照组大鼠左心室前外侧壁相同部位标本作对照。细胞色素氧化酶孵育采用DAB结合铈基法,用亚铁氰化钾半还原的锇酸后固定取代电子染色。实验组和对照组标本处理、孵育反应,电镜观察和照相条件等均相同。结果分析随机取样,对两组动物的电镜照片的各50个线粒体结构和细胞色素氧化酶反应进行图象分析。分析参数包括每个线粒体的面积、周长,形状因子(圆形度),     

单抗—药物偶合物对HL60细胞特异性结合与内化的研究

我们在电镜水平上用胶体金标记技术研究H198单抗与柔红霉素(DNR)偶合物(HI98-DNR-Au)对HI98抗元的特异性结合和内化作用。结果表明HI98-DNR-Au与HL60细胞在4℃孵育60分钟后,可见金颗粒与100％HL60细胞的表面膜结合;在上述条件孵育后,然后再在37℃中孵育15分钟,金颗粒可在30％的细胞胞浆内以及8％的核内出现;胞浆内的金颗粒可随孵育时间的延长(30’,60’,120’和240’)而明显增加,而表面膜上的金颗粒则随时间的延长而减少,金颗粒通过吞饮泡的形成而内化。在吞饮泡内簇集的金颗粒可融合成金斑块或破碎成细粒,一些金颗粒通过吞饮泡的膜或胞膜进入胞浆以及通过核膜而进入核内。但作为对照,HI98-DNR-Au与CEM细胞以及葡萄球菌A-蛋白     

肾小管上皮细胞缺血性损伤的细胞化学观察

本次实验采用Ca~(2+)细胞化学定位法(用草酸——焦锑酸钾法对细胞内Ca~(2+)进行选择性定位)、膜通透性细胞化学示踪法(用硝酸镧作示踪剂显示质膜通透性)与EDX电镜分析技术及超微结构相结合,观察了肾近端小管上皮细胞缺血损伤情况(钳夹大白鼠肾血管造成缺血模型)以及肌苷、种芎对其的影响,探讨了细胞缺血损伤后Ca~(2+)、质膜的变化以及药物对细胞缺血损伤起保护作用的机理。结果显示:(1)缺血60分钟,细胞严重肿胀,线粒体水肿,微绒毛变形、脱落。缺血60分钟复流24小时,不给药组大部分细胞坏死,质膜严重损伤,参照keith对细胞损伤的分期标准进行分类、统计,Ⅲ、Ⅳ期细胞占89％,而用药组缺血损伤明显改善,质膜损伤减轻,Ⅲ、Ⅳ期细胞分别占33％(肌苷组)和23％(川芎组)。(2)正常肾近端小管上皮细胞,Ca~(2+)以细小颗粒状形态分布于细胞核、线粒体及胞浆中,镧以细颗粒形式沿基底膜、细胞间隙及基侧褶间隙均匀沉淀;缺血60分钟,胞浆中、核内及线     

电镜酶细胞化学技术及其应用

电镜酶细胞化学是在超微结构水平上研究酶的活性定位和变化的新技术。用此技术,有利于综合分析细胞的超微结构特征与酶活性分布之间的相互联系,对研究各种生理病理情况下酶的定位和代谢特征有很重要的意义。近年来,我们摸索、引用或改进了十八种酶(5′—核苷酸酶、核苷二磷酸酶、钠—钾—ATP酶、Mg~(++)-ATP酶、Ca~(++)-ATP酶、细胞色素氧化酶、腺苷酸环化酶、糖原合成酶、LDH、MAO、ALP、ACP、AChE、SDH、CMP酶、TPP酶、G-6-P酶、NADP酶)的电镜细胞化学方法,并应用于高压氧医学和脑肿瘤酶活性定位研究。在应用中我们体会到:(1)用2％多聚甲醛—0.5％戊二醛(0.1M二甲砷酸缓冲液或PBS配成,加6.5％蔗糖)混合固定液固定对大多数酶是合适的。少数酶如SDH不耐固定,须用     

植物种子萌发过程的多胺氧化酶定位方法研究

多胺氧化酶 (PAO)在植物的生长发育过程起着重要作用。开展PAO的细胞定位研究是探讨该酶生理功能的有效途径。氯化铈法是常用的电镜PAO定位方法 ,此法利用PAO能与铈离子结合形成不溶性的电子致密物 铈沉淀 ,用电镜观察确定PAO在细胞超微结构中所存在的部位。1　材料与方法花生种子、菜豆种子、黄豆种子。种子经消毒处理后 ,浸泡后于湿润的滤纸上发芽。取萌发 5日的幼叶、顶芽、子叶、胚轴、根 ,4 %戊二醛固定洗涤 ,常温孵育 30～ 6 0min(孵育液每样用10mmol LCeCl 3∶10mmol L腐胺∶pH7.0磷酸缓冲液 =2∶2∶1,对照 10mmol LCeCl …     

大鼠肺巨噬细胞iNOS电镜细胞化学定位显示法

目的;对大鼠肺泡巨噬细胞NOS进行细胞内定位显示。方法：由大鼠支气管肺泡灌洗液中获取肺泡巨噬细胞,富集制备成单层细胞爬片。在37℃,5％CO2的二氧化碳培养箱中,用LPS（1g/L）刺激24h以诱导肺泡巨噬细胞NOS表达。采用NADPH－d电镜细胞化学术对肺泡巨噬细胞NOS进行定位显示。结果：活化的AM胞浆内可见大量颗粒状电子密度沉淀。结论：NADPH－d电镜细胞化学方法所显示的AM诱导型NOS是胞浆酶。     

扁桃酸酰胺作用阴道滴虫的电镜观察

扁桃酸酰胺(Mandelic Amide)已证实为桃叶膏抗滴虫的有效成份,为探讨此成份的杀虫机制,作者曾作了光镜下的形态观察,而对电镜下的超微结构改变未见有过记载。本文就电镜下的观察结果报导如下。观察方法是在培养48小时的滴虫培养管内加入40mg/5ml扁桃酸酰胺,培养48小时后制备样品。另外取一滴虫培养管不加药品作对照组,并与实验管同时进行样品制备。样品制备是将上述两种标本,先以2.5％戌二醛液在室温下作一级固定,15分钟后,用pH7.4磷酸缓冲液水洗1小时,再入1％四氧化锇二级固定2小时。用乙醇进行系列脱水,用环氧树酯包埋处理48小时,作超薄切片,切片用醋酸铀和柠檬铅作双染色,随后在H—600型电镜下观察拍片。     

镧示踪法在表皮屏障功能研究中的应用

金属镧是电子显微学中使用的最小的示踪元素之一。它是正三价离子 ,其原子的直径为 0 .11nm ,常用的化合物为硝酸镧 ,是一种水溶性物质。在生物学和电子显微学中主要利用镧在电镜下产生电子致密的特性来描述细胞间隙和细胞连接结构。本实验用硝酸镧作为示踪剂来揭示表皮的屏障功能。1　材料与方法本实验用裸鼠作为实验动物。将 0 .0 5mol L的Tris缓冲液配制的含有 8%蔗糖、8%硝酸镧溶液 ,pH 7.6 ,与 2 %多聚甲醛、2 %戊二醛、0 .0 6 %氯化钙 ,用 0 .1mol L二甲砷酸钠缓冲的固定液按 1∶1混合 ,将裸鼠的表皮样品在此混合液中室温下固定 1h …     

培养脊神经节细胞酸性磷酸酶的超微分布

我们已经先后报道了线状溶酶体 (ＮＬＹ)在中枢神经细胞 (大脑大锥体细胞 ;小脑浦肯野氏细胞 ;脊髓前角运动细胞 )的分布[1] ,但至今未见神经节细胞ＮＬＹ的报道。本研究采用酸性磷酸酶[2 ] (ＡｃｉｄＰｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ ,ＡＣＰ)的电镜酶细胞化学技术显示初代培养的胎鼠脊神经节细胞ＡＣＰ的分布 ,并进行了电镜观察 ,旨在探讨脊神经节细胞ＮＬＹ的存在和研究其生物学特性提供依据。材料与方法实验动物选用妊娠 14日的健康孕鼠 (Ｗｉｓｔａｒ种系 ) ,拉断头颈处死消毒后剖开子宫 ,取出胎鼠 ,超净工作台中 ,解剖镜下分离出胎鼠脊神经节 ,…     

免疫金法与ABC法在电镜包埋前染色之比较

包埋后免疫电镜术虽能精确定位抗原,但难度大。本文用胶体金标记法与ABC法对人鼻中线恶网瘤组织在树脂包埋前作抗人T细胞免疫染色,并对两种方法进行比较。简述如下:临床活检鼻中线恶网组织,经4％多聚甲醛加1％戊二醛4℃固定,振动切片(50μm),PBS冲洗,在预先硅化的载玻片上作免疫染色:鼠抗人T细胞McAb(Dako公司出品)孵育过夜;金标羊抗鼠抗体(10nm,军科院基础所出品)室温下孵育1小时,再将切片倾入小瓶,经1％锇酸后固定,常规脱水包埋及超薄切片,不作铀铅复     

使用AMP缓冲液的反应液的枸椽酸铅法透射电子显微镜的大白鼠肝与肾硷性磷酸酶活性检出局在的再探讨

硷性磷酸酶(ALP)活性的酶的组织化学检出常应用马屋原等的构橡酸铅法其反应液使用Tris—HCl缓冲液。我们设想使用临床生化学定量测定血清中的ALP酶所使用IFCC法的反应液中的AMP缓冲液能否代替Tris—HCl缓冲液,使活性得以很好保存,透射电镜下能否使反应产物更加微细,为此我们进行了进一步探讨。材料和方法:实验动物采用Wistar种系的体重约150克的大白鼠,乙醚麻醉下用含8％庶糖pH7.4的0.1M二甲砷酸钠缓冲液缓冲了的0.5％戊二醛进行10分钟灌流凼定。立即取肝肾细切后,用冷二甲砷酸钠4℃洗一小时。使用microslicer(未冻结切片机)作成未冻结的40μm切片,用     

纤毛细胞膜特化结构的冷冻蚀刻研究

六十年代以来,冷冻蚀刻技术的应用和发展,能较满意地揭示生物膜上某些特化区域的蛋白分子排列方式和三维图象。本文应用此技术,研究纤毛细胞表面特化结构。家兔整体麻醉后,开胸取新鲜气管上皮层数条,用0.IM磷酸缓冲液配制的2％戊二醛(PH7.2)在4C固定一小时,洗涤24小时后浸入30％甘油生理盐水,待组织条沉没数分钟后,取出样品,置于样品台上,用液氮冷冻后,迅速放入FD—3A 冷冻蚀刻仪中,在真空优于2×~(-6)Torr下做断裂,蚀刻和喷涂白金及碳,用10％次亚氯酸钠溶化喷涂样品,洗净复型膜,捞取在载网上,待干后用TEM—100CXⅡ电镜观察。     

铈在磷酸酶电镜细胞化学中的应用

在磷酸酶细胞化学反应中,酶作用于底物所产生的初级反应物为磷酸,日前常用铅为捕捉剂,与磷酸反应形成高电子密度的磷酸铅沉淀,在电镜下探测。由于铅捕捉剂对酶有一定抑制作用,而且容易产生非特异性反应,近年来人们开始寻找新的捕捉剂,其中铈是较理想的一种,我们采用这种新捕捉剂铈开展了CMP酶和G—6—P酶等磷酸酶的细胞化学反应,获得了较好的效果。铈为捕捉剂的电镜细胞化学基本方法和步骤与我们以前报道的铅法相同(见细胞生物学杂志7增:3-14),但细胞化学反应液配方不同。CMP酶细胞化学反应液内含有2mmol/LC-5′-MP、40mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)、2mmol/L氯化铈(CeCl_4)、5mmol/L氯化锰和     

二种固定方法对扫描电镜用植物细胞冷冻割断样品的影响

本文用冷冻割断法在扫描电镜下观察了大蒜(Allium sativum L.)根尖分生组织细胞内部的三维结构。样品制备采用了两种固定方法:冷冻割断前只用1％的锇酸固定的材料易在细胞质和细胞核之间断开;而先用Bouin‘s液固定,再用1％锇酸固定的材料易使细胞核被断开。据此认为前一固定法适于研究细胞质的内部结构(如细胞骨架纤维、线粒体、内质网等)及其三维分布关系;后一种固定法适于核内结构(染色质、核仁、核基质纤维)的三维图象的研究,特别是核仁纤维中心染色质的三维结构。     

胰腺胰岛分泌细胞的免疫金标记

本实验应用豚鼠抗胰岛素抗体及胶体金探针对常规Epon812包坦后的大鼠胰腺组织胰岛素分泌细胞进行电镜免疫金染色,获得较满意的结果。材料与方法:取大鼠新鲜胰腺组织,常规透射电镜制样。半薄切片光镜下精确定位胰岛。超薄切片捞于不锈钢载网上。免疫金染色程序为:①8％高碘酸钠室温腐蚀20分钟;②0.01MPBS(含1％BSA)pH7.2洗涤3次,每次5分钟;③5％BSA孵育20分钟,以封闭非特异性结合位点;④豚鼠抗胰岛素抗体