用差减抑制杂交方法鉴定太谷核不育小麦花药败育过程中的特异表达基因

以太谷核不育小麦败育花药为对照群体，可育花药为目标群体，进行抑制差减杂交。用经过败育花药差减的可育花药cDNA群体构建了一个差减抑制杂交文库。结果显示，插入片段的大小主要集中在300－500bp之间。随机选取8个克隆进行Northern杂交分析，结果其中7个克隆在可育花药和不育花药之间的表达存在差异。对其中16个插入cDNA片段测序后与GenBank同源性比较表明，共获得未重复序列13条，占81％，其中与已知功能基因同源的3条，与EST库中的序列同源的7条，新的cDNA片段3条。     

SSH法获取水稻矮化突变体相关的cDNA片段

利用抑制性消减杂交（Suppressive subtraction hybridization,SSH)分离水稻矮化突变体dwarf69与其野生型对照品系特光矮-2（Oryza stiva,TGA-2indica)间表达有差异的cDNA片段,分别以dwarf69作为驱赶子,TGA-2为检测子,以及以dwarf69作为检测子,TGA-2为驱赶子建立了两个差异表达cDAN文库,分别代表在TGA-2和dwarf69特异表达的cDNA,经反式Northern检测这两个文库共得到10个阳必天色隆,序阢分析表明有两个序列为水稻中首次报道,一个序列有有相应的基因组序列报道,但其cDNA序列是首次报道。     

玉米Na+/H+反向转运器编码基因ZmNHX的克隆及其表达特性分析

植物液泡膜Na^ ／H^ 反向转运器在植物耐盐性方面发挥着重要的作用。根据序列同源性比较分析结果,利用RACE技术获得了一个与水稻Na^ ／H^ 反向转运器基因OsNHX1具有高度序列同源性的玉米Na^ ／H^ 反向转运器基因(命名为ZmNHX)的全长mRNA序列。对正常及胁迫条件下的玉米幼苗进行Northern blot分析发现,ZmNHX基因的表达受NaCl、LiCl、甘露醇和ABA诱导。玉米ZmNHX在盐胁迫适应过程中可能起着非常重要的作用。     

芦荟耐盐差异表达基因文库的构建

为了弄清景天酸植物芦荟的耐盐、耐旱机理，应用抑制性消减杂交技术，构建了库拉索芦荟的盐诱导组织与正常组织差异表达的cDNA消减文库，并做了初步鉴定。分别从库拉索芦荟的正常叶片组织及高盐诱导叶片组织中提取poly(A)^ RNA，依次合成单链及双链cDNA，酶切成平均大小为400～600bp的片段；将高盐诱导组织eDNA分为两组，分别与两种不同的接头连接，再与正常组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR；获得的产物与T／A载体连接构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增。经检验证明，构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率，非特异性cDNA片段被有效地消减，而特异表达的cDNA得到富集。所构建的库拉索芦荟高盐诱导组织cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆高盐特异性表达的未知新基因奠定了基础。     

高冰草与小麦体细胞杂种后代的耐盐性和麦谷蛋白分析

利用不同浓度的NaCl处理高冰草、小麦及高冰草和小麦体细胞杂种F3代的幼苗,结果表明,高冰草具有耐盐单子叶植物典型的特征.亲本小麦属非盐生植物,抗盐能力较弱,当NaCl浓度达150mmol/L时已有盐害影响,浓度超过250mmol/L后全部死亡.高冰草在NaCl浓度为250mmol/L时盐害现象才比较明显;杂种植株的耐盐性远高于小麦,同时也高于高冰草.在100mmol/L以上NaCl处理组中,杂种的死亡率远较小麦低,甚至低于高冰草.生长量及各项生理指标的测定结果也表明杂种的耐盐性不仅远比其亲本小麦(济南177)高,而且还高于高冰草,表明体细胞杂交引起了杂种中盐胁迫应答相关基因表达的变化.杂种F1-F3代单粒种子的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)比较分析发现,杂种含有部分与双亲迁移率一致的亚基及少数与双亲迁移率不同的亚基,部分高冰草的特有亚基在杂种中消失,表明体细胞杂交引起了杂种中HMW-GS基因及表达的明显变异.这些研究结果对于体细胞杂交机制的探讨和利用体细胞杂交技术进行牧草耐盐和品质改良的生物技术育种有重要意义.     

甜菜无融合生殖系花期差异表达基因cDNA文库的构建

为了克隆M14(M14是栽培甜菜与白花甜菜杂交产生的单体附加系,由于附加的白花甜菜第9号染色体上存在无融合生殖基因,其传递率可高达97.5%)品系中无融合生殖相关基因,应用抑制消减杂交方法,在甜菜开花的关键时期减数分裂期取样,建立了甜菜无融合生殖系M14与能够进行正常有性生殖的二倍体甜菜A2Y之间差异表达基因的cDNA文库,并对295个克隆进行了测序,共测得179个表达序列标签(Expressed Sequence Tags,ESTs),通过对生物信息学数据库资料的查询,共得到了89个与已知基因同源的ESTs,90个新的ESTs,选择其中2个EST进行了RT-PCR鉴定,证明在M14中特异表达.以上结果为以后克隆与无融合生殖相关的全长基因打下了基础.     

抗稻瘟病新基因pi-hit-1的克隆与功能研究

采用差异显示法(DD-PCR)寻找易感稻瘟病的突变品系与野生型对照品系中的差异表达基因。结果发现与野生型对照相比,Rubisco小亚基、pi-hit．1(AF450251)和pi-hit-2(AF448491)基因在易感稻瘟病的突变品系中高表达,pi-hit-1和pi-hit-2是功能未知的新基因。进一步采用电子克隆和RT-PCR方法克隆了pi-hit-1基因的全长eDNA(AF514859),该基因编码的蛋白质属于ATP依赖的Clp蛋白酶家族。分析pi-hit-1基因的组织特异性表达发现,此基因在叶片组织特异表达。进一步设计接种诱导实验研究pi-hit-1基因表达与水稻稻瘟病易感性的关系。在易感稻瘟病的突变品系中pi-hit-1受稻瘟病菌诱导,接种后其表达量明显升高,而野生型对照品系pi-hit-1基因表达在接种前后无明显变化。比较易感稻瘟病的突变品系与对照品系pi-hit-1基因序列差异发现,稻瘟病敏感品系中pi-hit-1基因第一外显子发生缺失突变使pi-hit-1蛋白功能缺失,导致突变品系易感稻瘟病。这些实验结果提示野生型pi-hit-1是稻瘟病抗性基因。     

优质小麦体细胞杂种中一种新的HMW麦谷蛋白亚基基因cDNA的克隆和测序

研究了在小麦(Triticun acetivum L．)与高冰草(Agropyron elngatum(Host)Neviski)不对称体细胞杂种优质株系Ⅱ-1．3中出现的迁移率与优质小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)一致的1B16亚基,通过Westem blot杂交证明了该亚基与普通小麦的1By16亚基有很强的杂交信号。依据Ⅱ-1-3中类似16亚基N端15个氨基酸序列设计简并引物,通过RT．PCR扩增Ⅱ-1—3 F4中未成熟胚种子总RNA,得到三条特异带(2．3、2．2、2．11kb),对其中分子量最大的一条2．3kb带谱进行了克隆、测序。该序列(p16BL-1,测序编号为473)长2298bp,包括2137bp的编码区和161bp的3’非编码区。同源性分析发现,该片段与普通小麦HMW Glu-IR、Glu1BY9同源性较高。利用RNA二级结构预测软件对该片段、GlulR和GlulBy9进行预测表明,所分离的基因片段为一新的HMW-麦谷蛋白基因。该片段所编码的氨基酸序列中,N端的99个氨基酸和C端的42个氨基酸均为典型的HMW麦谷蛋白保守区。中间重复区中6肽重复22个,9肽重复7个。通过对其蛋白质二级结构的预测发现,在460～470氨基酸附近比GlulR和GlulBy9多一个α螺旋区和一个转角。该片段在Genbank中的编号为AY249141,所翻译的蛋白序列编号为AA074630。本文揭示了体细胞杂交引起小麦基因序列变化及与体细胞杂种小麦优良品质的相关性,为小麦品质育种研究提供了新途径。     

抑制消减杂交法分离血管内皮细胞中表达的TNFα相关基因

介绍使用快速而高效地分离差别表达基因的新方法———抑制消减杂交法 ,克隆了在TNFα作用后血管内皮细胞中的差异表达cDNA。经反向Northern杂交试验证实。为进一步研究血管内皮细胞中表达的TNFα作用相关基因打下基础。     

转"全鱼"GH基因鲤鱼胸腺发育差异表达基因的筛选与鉴定

采用显微注射方法,获得了转"全鱼"生长激素(GH)基因鲤鱼(转基因鱼),应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建了4月龄F3转基因鱼胸腺发育差减cDNA文库,筛选并鉴定了与胸腺发育相关的81个与已知基因同源的表达序列标签(EST).这些EST至少代表69个基因.根据基因的作用将其分为5类:18个与免疫和细胞防御有关;23个参与细胞生长、发育和分化等代谢过程;3个参与细胞信号传导和周期调控;8个在转录和表达调节中发挥作用;17个为核糖体蛋白基因,表明转基因鱼胸腺细胞处于活跃的蛋白合成状态.应用RT-PCR和虚拟Northern杂交技术进一步证实其中的若干基因在转基因鱼胸腺组织中的表达量增加.实验结果为阐明转植GH基因促进鲤鱼胸腺发育的相关分子机制提供了依据.     

雪花莲外源凝集素基因的克隆及其多态性分析

从雪花莲叶片中分离出长度为４８４ｂｐ的雪花莲外源凝集素ｃＤＮＡ,包含了完整的雪花莲外源凝集素编码序列。通过限制性酶切图谱及ＤＮＡ序列分析,从中筛选出５种核苷酸且氨基酸序列均有差别的外源凝集素在１,ＧＡＮ１２,ＧＮＡ１３,ＧＮＡ１４和ＧＮＡ１５。     

新型皱纹盘鲍防御素hd-def的cDNA序列分析、基因组克隆及表达研究

从构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中筛选到了鲍防御素基因EST.通过序列分析发现该基因的全长cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成.该前体的成熟肽含42个氨基酸(6个Cys),推测分子量为4323Da,等电点为8.02.氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性较高,最高可达70%.因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,将其命名为鲍防御素hd-def.采用基因组步移法获得了全长4032bp的基因组序列.分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497bp、2357bp和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中.用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达.实验检测了5种组织,发现hd-def基因仅在肝胰腺中表达,具有明显的组织表达特异性;其表达属于诱导型表达,提示该基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染.     

茶尺蠖普通气味结合蛋白基因片段cDNA的克隆与序列分析

根据同源性设计简并性引物,采用RT-PCR方法扩增出了茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBP1和GOBP2的基因cDNA片段,大小分别为415 bp和352 bp.测序结果在NCBI中经BLAST搜索,结果表明,两者与已报道的鳞翅目昆虫的气味结合蛋白基因片段或全长的同源性分别为79%~83%和78%~90%.根据两个核苷酸片段推导出的氨基酸残基数分别为138个和117个,均具有6个保守的半胱氨酸位点,符合典型的气味结合蛋白的特点.经BLAST搜索,与其他鳞翅目昆虫GOBP1和GOBP2氨基酸序列的同源性分别为62%~82%和76%~88%.     

栉孔扇贝脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆及其特征分析

作为模式识别蛋白的脂多糖葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein,LGBP)在无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要作用。本研究以鳗弧菌作为病原感染栉孔扇贝,构建全个体cDNA的质粒文库,用T3引物对文库进行随机测序得到一个667bp的cDNA片段(编号：c1305ct320cn336),它与普通蚯蚓的体腔裂解因子前体基因、海胆的β-1,3-葡聚糖酶、非洲疟蚊的革兰氏阴性细菌结合蛋白等有同源性。用T7引物对该克隆测序得到其3’末端。通过SMART-RACE技术克隆得到该克隆的全长cDNA序列。栉孔扇贝LGBP基因由1850个核苷酸组成,它有一个poly A尾巴,编码一条440个氨基酸的多肽。该多肽的分子量估计为47159．076Da,等电点为5．095。推导的氨基酸序列与蓝虾、斑节对虾、海胆、非洲疟蚊、淡水螫虾、普通蚯蚓及普通红蚯蚓等无脊椎动物模式识别蛋白具有高度的同源性。经用Garnier法预测,栉孔扇贝LGBL的二级结构包含螺旋构象10％,折叠片构象17％,转角构象21％,无规则卷曲53％,各种构象所占比例与普通红蚯蚓的体腔裂解因子前体相近。     

大熊猫朊病毒基因克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊病毒基因序列设计引物对,采用PCR方法扩增了大熊猫的朊病毒基因,将其克隆到T-Easy载体,序列测定及分析表明所克隆的大熊猫PRNP基因(GeneBank收录号为AF327449)片段为795bp,编码264个氨基酸的前体蛋白,推测其分子量约28．5ku。与已报道的牛(GeneBank收录号为AF455119)、绵羊(GeneBank收录号为AF367623)的相应序列作比较分析,核苷酸序列同源性分别为99％和83％,其编码的氨基酸同源性均为100％。在所克隆的大熊猫PRNP基因中未发现与朊病毒敏感性连锁的氨基酸多态性位点。     

猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)疫苗株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

根据猪瘟病毒基因组的序列设计合成了覆盖HCLV基因组全部序列的5对引物，通过RT-PCR从感染家兔脾脏中扩增获得了包含HCLV(hog cho1era lapinized virus,HCLV)基因组全序列的5个cDNA片段，并将它们分别克隆至pGEM-T vector中。然后将这5个cDNA片段按它们在HCLV基因组上的位置从5’端至3’端的顺序依次通过酶切连接，一并克隆到pPo1y2载体中得到HCLV基因组全长cDNA的质粒pPOHCLV。序列分析表明，HCLV基因组长度共12310bp，有一个大的ORF，编码-3898个氨基酸的多聚蛋白。其5’—NCR和3’—NCR长度分别是374nt和239nt。与非兔化毒株相比较，HCLV基因组在12133nt处有12个碱基的插入CTTTTTTCTTTT，该序列可能是病毒在适应兔体增殖过程中形成的。基于基因组全序列及其所推导的氨基酸序列的同源性分析表明，毒株的亲缘关系的远近与它们的毒力之间并没有相关性。     

Isolation and characterization of the heavy metal resistant bacteria CCNWRS33-2 isolated from root nodule of Lespedeza cuneata in gold mine tailings in China

A total of 108 strains of bacteria were isolated from root nodules of wild legumes growing in gold mine tailings in northwest of China and were tested for heavy metal resistance. The results showed that the bacterial strain CCNWRS33-2 isolated from Lespedeza cuneata was highly resistant to copper, cadmium, lead and zinc. The strain had a relatively high mean specific growth rate under each heavy metal stress test and exhibited a high degree of bioaccumulation ability. The partial sequence of the copper resistance gene copA was amplified from the strain and a sequence comparison with our Cu-resistant PCR fragment showed a high homology with Cu-resistant genes from other bacteria. Phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequence showed that CCNWRS33-2 belongs to the Rhizobium-Agrobacterium branch and it had 98.9% similarity to Agrobactrium tumefaciens LMG196.     

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析

为研究紫菜抗逆抗病的分子机制,以本实验室建立的条斑紫菜表达序列标签(EST)和全长cDNA富集文库,结合PCR技术,克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的cDNA及基因组DNA全长序列,并进行了序列特性相关分析.研究结果表明:该基因cDNA序列全长为958个核苷酸,包含一个完整Mn-SOD基因的ORF,编码224个氨基酸和终止密码子;该基因在基因组中序列长度为1416bp,包含4个外显子和3个内含子,这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子,也不同于人的5个外显子和4个内含子;该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9%,第三位密码子的GC含量高达84.9%;序列中包含4个与Mn2 的结合位点及一个保守的金属结合结构域,预测分子量为24469.09Da,等电点为5.99;条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构,都有6个跨膜α螺旋结构域;由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻相似性为57.7%,系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近.这是该基因在红藻门中的首次报道.     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。