利用多重PCR同时检测WSSV和MBV两种对虾病毒的研究

研究了检测斑节对虾(Penaeus monodon)的主要致病病原——对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)及斑节对虾杆状病毒(monodon baculovirus,MBV)的技术。用多重PCR检测方法,设计了两对特异性引物,从不同虾池中收集斑节对虾,提取DNA模板,同时检测两种对虾病毒。研究结果表明：该方法检测灵敏度高、特异性好,可检测至每毫克组织100个病毒粒子;从对虾组织中提取的DNA模板对病毒DNA的扩增无抑制,适合于对虾中两种病毒的同时检测。     

中国对虾性别相关片段的初步研究

采用mRNA双随机引物差示技术分离中国对虾性别相关片段。然后利用这些引物组合对中国对虾的基因组进行了PCR检测，发现其中两对引物组合可以扩增出具有性别相关性的片段。     

栉孔扇贝EST中微卫星标记的筛选

使用RepeatMasker软件在栉孔扇贝的6935条ESTs中发现了42条微卫星序列。选取其中的7个序列，根据微卫星位点的旁侧序列设计引物，并对设计出的引物在中国、日本、韩国野生群体中进行多态性检测，发现有6对引物能产生扩增产物，其中有3对引物可望在以后的群体分析及连锁图谱的构建中加以应用。该结果初步证实了在栉孔扇贝的ESTs序列中存在微卫星位点，从而为扇贝生物中微卫星标记的筛选开辟了新的途径。     

中国对虾部分基因组文库构建和微卫星DNA序列的筛选

以中国对虾为实验材料,提取肌肉的基因组DNA。经Bsp143Ⅰ酶切后,回收500～1000bp的DNA片段,与经BamHⅠ酶切并去磷酸化的PUC19重组,将重组载体转入大肠杆菌DH5α中。然后将其涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,过夜培养后,经蓝白斑筛选,构建对虾部分基因组文库。采用载体质粒的通用引物进行PCR检测插入片段的大小,对基因组文库进一步进行筛选。从建立的文库中选取100个片段大小合适的克隆进行测序,其中54个克隆的DNA插入片段含有微卫星序列,共获得了111个微卫星序列,在GenBank中注册了12个微卫星序列。本实验中还发现1个含有23bp的小卫星序列。     

不同年份对虾白斑综合征病毒基因组差异的微阵列分析

根据对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)全基因组序列的分析与应用,设计了190对引物,覆盖全基因组绝大多数可预测的开放读框(ORF).扩增相应基因片段,在尼龙膜上点样,制备成为DNA微阵列.收集了1996年和2002年感染阳性对虾,分别提取纯病毒基因组DNA,用地高辛标记后与DNA微阵列杂交.与1996年病毒株相比较,2002年病毒株缺失了wsv479、wsv482、wsv489和wsv493.运用PCR技术验证了DNA微阵列杂交结果的可靠性.     

松杨栅锈菌小种特异性DNA片段的SCAR标记转换

用SCAR标记技术对松杨栅锈菌生理小种特异性DNA片段进行了转化和检测研究.通过对RAPD随机引物的扩增筛选,发现随机引物BAO118扩增产生的约700bp的DNA片段与松杨栅锈菌小种特异性相关联.将该片段进行回收、TA克隆、双向测序和序列整合后,序列全长685bp,3'端有BAO118随机引物序列.根据整合后序列,用Primerselect软件设计了一对包含随机引物序列的简并引物对.用该引物对对供试菌样进行PCR扩增,成功获得了松杨栅锈菌小种685bp的SCAR标记.用该标记进行田间混合孢子菌样、单孢子接种菌样DNA检测,均得到了685bp的DNA片段,不受寄主DNA和孢子菌系类型的影响,具有较好的稳定性和特异性.     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和凡纳滨对虾 (Litopenaeus.vannamei )血清酚氧化物酶活性的研究

研究了中国明对虾和凡纳滨对虾血清酚氧化酶（PO）的生理功能和活性影响。结果表明,中国明对虾和凡纳滨对虾血清中都存在PO,主要以酚氧化酶原（proPO)的形式存在,并且都可以被可以被胰蛋白酶、SDS和酵母聚糖激活。抗凝剂SSS（Shrimp Salt Solution)会影响中国明对虾和凡纳滨对虾血清中的PO活性引起的PO活性的降低。正常状态下中国对虾血清中PO活性较凡纳滨对虾血清PO活性低。中国明对虾血清PO最适温度为50℃,最适pH为8．5,而凡纳滨对虾PO最适温度为45℃,最适pH为7．5。     

一种基于磁富集靶序列PCR的扩增方法 及其灵敏度检测

以亲和素修饰的磁性纳米颗粒γ-Fe2O3为载体,提出了基于磁富集靶序列PCR扩增方法。首先将结合有生物素标记特异性引物的靶序列富集到亲和素修饰的γ-Fe2O3纳米颗粒表面,然后通过变性获取单链的靶序列,再进行PCR扩增。同时,优化了靶序列和特异性引物杂交的最适温度和磁性纳米颗粒γ-Fe2O3的最佳用量,并对该方法的灵敏度进行了检测。通过实验得出:该方法中,最适的杂交温度为53℃,磁性纳米颗粒的最佳用量为90μg,靶序列的最低检出浓度为5×10-10ng/mL。     

犬细小病毒Proofman-LMTIA检测方法

为评价Proofman探针的梯型熔解温度等温扩增技术（LMTIA）检测核酸的性能,以Proofman-LMTIA快速检测犬细小病毒为例,采用实时荧光定量PCR方法和微滴式数字PCR方法进行对比分析。针对犬细小病毒基因的特异性序列设计引物和Proofman探针,通过优化反应条件,对方法的特异性、灵敏度进行测试,再通过实时荧光定量PCR方法、微滴式数字PCR进行对比验证。结果表明,所建立的Proofman-LMTIA方法在最适反应温度为61℃时,与猫、犬等基因组DNA无交叉反应,灵敏度达到8拷贝/μL,且能够在20 min内完成检测,与实时荧光定量PCR和数字PCR方法结果具有一致性。该方法不仅在恒温条件下即可扩增,且具有快速、灵敏、高效等优点,适用于病毒的现场快速检测。     

中国对虾人工选育快速生长群体不同世代间的AFLP分析

利用7对AFLP引物组合检测了中国对虾连续五代选育群体基因组DNA的遗传结构,根据AFLP分析结果计算了选育世代群体间的遗传相似系数和遗传距离.结果表明,AFLP标记表现出较高的多态检测效率,7对引物共产生500余条带,平均每对引物组合检测到33.7个多态性标记,平均杂合度为0.0854～0.1025,非常适合于遗传多样性分析.结果显示,随着选育世代的增加,选育群体的遗传多样性呈现下降趋势,但随着选育时间的延长,群体之间的分化逐渐降低,群体的遗传结构开始趋于稳定,成为一个品系.     

微卫星标记技术在大豆遗传作图中的应用

根据文献报道的序列有选择地合成了２０对ＳＳＲ引物,在用以遗传作图的两个亲本中进行了扩增,有１７对引物的扩增产物具有多态性大小范围为７０－３００ｂｐ。其中扩增产和大小差异小于１０－２０ｂｐ的等位基因可通过４％琼脂糖凝胶电脉分开,介绍了多次眯样和多引物ＰＣＲ技术。Ｘ＾２显著性检验证明其符合孟德尔式遗传方式,遗传连锁分析表明其中三个微卫星标记加锁     

丝羽乌骨鸡微卫星多态性及其与产蛋性能的关系

选用12个微卫星标记，通过对丝羽乌骨鸡多态性扩增，计算出这些微卫星标记座位的等位基因频率、多态信息含量、群体杂合度。通过标记多态性与产蛋性状的最小二乘分析和多重比较，进行了分子标记与产蛋性状的相关分析。结果表明，12个微卫星标记中，9个表现出丰富的多态性。微卫星标记座位平均检测到4．5556个等位基因(3～7个)。9个微卫星标记平均多态信息含量为0．6072。标记平均杂合度为0．7423。通过最小二乘分析，检测到4个标记G31913、X82867、Z95315、G01672与3种性能指标(4个月连产蛋量、开产蛋重、500天产蛋量)存在显著相关。标记G31913中基因型AB的开产体重最小二乘均值最高，Z95315的基因型CC的开产蛋重、开产体重最小二乘均值最高，标记G31913的基因型AB和标记Z95315的基因型CC有望作为开产蛋重、开产体重早期选择辅助标记，标记X82867基因型为CD的产蛋量较低，而基因型为AB的产蛋量相应较高。     

应用RAMP分子标记探讨仲彬草属的种间关系

对仲彬草属Kengyilia14个种和1个变种进行了RAMP分析。结果表明物种间遗传差异明显。40个引物组合产生的254条DNA扩增片段中，216条(85．0％)具有多态性，每个引物组合可扩增出l一9条多态性带，平均5．4条。遗传相似系数变化范围为0．327—0．886，平均值为0．549。同时，形态相似、地理分布一致的物种有一定的亲缘关系，聚类在一起。这与RAPD、形态学和细胞学等分析结果基本一致。因此，RAMP评分子标记是评价仲彬草属种间关系十分有效的方法。     

斑马鱼和稀有(鱼句)鲫的SCAR标记建立及其异种克隆胚的检测

以斑马鱼和稀有(鱼句)鲫的基因组DNA进行RAPD分析,获得特异的RAPD标记,经克隆、测序,合成特异性引物并优化SCAR-PCR反应条件,将四个特异的RAPD标记转化成稳定的SCAR标记.SCAR1、SCAR3和SCAR2、SCAR4分别在斑马鱼与稀有(鱼句)鲫基因组DNA扩增中产生单一的条带,可作为区分斑马鱼和稀有(鱼句)鲫的分子标记.此外,SCAR3和SCAR4还可以分别将斑马鱼和稀有(鱼句)鲫从鲫鱼、白鲢、鲤鱼、鳊鱼等其它鱼类中鉴别出来,从而成为良好的种质鉴定分子标记.在此基础上,选用SCAR标记进行了斑马鱼与稀有(鱼句)鲫配合的鱼类异种克隆胚胎鉴定研究,结果发现,克隆胚由供体核支持发育而来.SCAR标记的获得,为鱼类异种间克隆胚胎和克隆鱼的检验,以及细胞核再程序化机制等重大理论问题的探索提供了重要的技术支持.     

抗 SMV 栽培大豆种质资源的 SCAR 标记指纹图谱分析

依据与ＳＭＶ（ＳｏｙｂｅａｎＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）抗性基因紧密连锁的共显性ＳＣＡＲ标记ＳＣＷ—０５６６０的序列测定结果，合成了两对ＳＣＡＲ（ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄＡｍｐｌｉｆｉｅｄＲｅ－ｇｉｏｎｓ）标记特异引物，对３０个栽培大豆品种进行了指纹图谱分析。结果表明，较短的片段Ｓ—５６００和Ｓ—０５６６０是抗病品种的特征性条带；而较长的片段Ｓ—５１０００和Ｓ—５１６００是感病品种的特征性条带。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，这两对引物扩增出的条带具有同源性。     

与大豆孢囊线虫病抗性相关的RAPD标记

利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术，对７个抗大豆孢囊线虫的大豆材料和１０个感病大豆品种的基因组ＤＮＡ进行了ＲＡＰＤ分析，供试的２００个随机引物均产生了清晰稳定的ＲＡＰＤ扩增产物，其中有２１个随机引物产生的ＲＡＰＤ扩增产物具有多态性。获得了５个与大豆孢囊线虫病抗性相关的ＤＮＡ片段，这些ＲＡＰＤ标记具有较高的重复性和稳定性，可辅助抗大豆孢囊线虫病大豆新品种的选育。     

SARS病毒特异性靶基因的多重PCR检测技术研究

本研究探讨了多重PCR技术在SARS病毒检测中的应用。根据香港中文大学在GenBank上公开发表的SARS病毒基因组cDNA序列,人工合成克隆特异性靶基因DNA片段,以此片段作为阳性样品,根据世界卫生组织推荐的进行单PCR与多重PCR检测分析。以单PCR法获得了121bp、182bp及302bp的靶基因片段3条;以二重PCR法获得了121bp+182bp、121bp+302bp与182b+302bp的靶基因片段组合;以二重PCR法获得了121bp+182bp+302bp的靶基因片段组合。结果表明:多重PCR技术可成功应用于SARS病毒的检测。