DNA技术中的设计进展

20世纪后半叶,随着蛋白质与核酸测序技术的问世,人类所掌握的生物大分子结构与功能的信息量暴涨,并逐渐进入了理性设计序列,以达到建构生物大分子功能性三级结构的自由王国。随着21世纪的到来,得益于多学科交叉集成,DNA技术中的创新性设计智慧此起彼伏。人类成功重装了低等生命的基因组,设计基因组底盘、构建人工进化平台,推出CRISPR基因编辑术,发明DNA折纸术,精确自组装纳米级三维DNA材料。另外,可将设计学的立体构成原理与基于用户体验的设计方法应用于生物信息学数据库建设。     

食源性致病菌的核酸可视微阵列检测技术

建立了一种快速检测3种食源性致病菌的核酸可视微阵列。分别设计与沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、志贺氏菌ipaH基因两端互补的基片探针和检测探针,设计3种基因的特异靶序列,特异靶序列或基因组DNA一端与固定在玻片上的氨基化基片探针杂交,另一端与巯基化检测探针连接形成复合体。使胶体金与检测探针结合,通过银染放大信号,检测3种食源性致病菌DNA。结果表明：通过对检测探针分别与基因组DNA、PCR产物及特异靶序列的杂交银染结果比较,3种结果都显示阳性,表明该方法可直接利用基因组DNA实现对食源性微生物的快速、高效检测,对3种食源性致病菌DNA的检测下限为1 pmol/L,在1 mmol/L ~1 pmol/L浓度范围内得到肉眼可见的清晰结果。探针与基因组DNA的杂交实验结果表明,微阵列对3种食源性微生物的检测具有较好的特异性。说明该技术可快速、简便检测食源性微生物,市场前景广阔。     

皮状丝孢酵母脂肪酸CoA连接酶 (Facl)基因的克隆与分析

从皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)中克隆了Facl基因及其5'-上游序列,并对Facl基因及其5'-上游序列进行了分析。根据前期的基因组文库测序结果,获得了898 bp DNA序列。以此为基础,2次使用染色体步移(Genome walking)方法,分别获得了854 bp和1 236 bp 5'-DNA序列。根据获得的5'和3'端序列,合成引物用于扩增Facl基因的全长DNA和c DNA序列。分析发现,皮状丝孢酵母Facl基因c DNA包含一个1 662 bp的开放读码框,DNA不含内含子序列。同时获得了482 bp的5'-上游序列。在5'-上游序列区域存在一系列预测的顺式作用元件。相似性分析的结果表明T.cutaneum和Rhodococcus erythropolis的Facl氨基酸序列相似性最高。该研究旨在为后继的Facl基因的功能和表达的研究、油脂代谢的遗传改造奠定基础。     

水产品和水体中创伤弧菌现场可视化环介导恒温扩增快检方法的建立及应用

目的 基于环介导恒温扩增(LAMP)技术建立水产品和养殖水域中创伤弧菌现场可视化快速、简便的检测方法。方法 以创伤弧菌作为研究对象,分别采用煮沸法和离心柱法提取基因组DNA,优化简便、快速的弧菌DNA提取方法;以创伤弧菌gyrB基因作为靶基因,设计筛选最佳的适于LAMP的引物序列,分别通过LAMP荧光扩增曲线(加SYTO-9 荧光染料),以及LAMP可视化观察扩增产物的颜色变化(加钙黄绿素),开展特异性、灵敏度和重复性试验分析。结果 确定煮沸法为适合于弧菌基因组DNA提取的快捷方法;优化筛选的引物可以特异地检测创伤弧菌,检测核酸浓度的灵敏度可以达到10 fg/μL,并且结果稳定、可靠。采用该方法进行实际样品的检测应用,在558份水体样品和655份水产品样品中,创伤弧菌阳性检出率分别为9.01%和8.60%,阳性检出率高于传统的分离培养鉴定结果。结论 低技术要求、低设备成本以及检测时间短使得可视化LAMP快检方法成为现场可使用的一个理想选择,对于水产养殖业来说也更方便。     

烟草基因组知识篇：2．基因组测序

基因组计划的最终目标是获取所研究生物体的全部DNA序列,一般包括三个图谱,即遗传图谱、物理图谱和基因组全序列图谱,并将基因以及其他有意义的特征定位于DNA序列中.人以及模式生物的染色体都不能直接进行DNA测序,因此首先必须将它们随机地"敲碎"(通过限制性内切酶酶切或超声波处理或DNA酶Ⅰ降解)变成成千上万的小片段,构建成不同水平和类型的基因组文库,例如YAC(yeast artificial chromosome,酵母人工染色体)文库、BAC(bacterial artificial chromosome,细菌人工染色体)文库和cDNA文库等.然后对文库中的每个克隆片段进行DNA测序,再对所有测定的每条序列经过计算机程序处理装配成染色体上完整的DNA序列.     

烟草基因组知识篇:3.基因组注释

<正>在完成序列的拼接后,得到的是很长的DNA序列、甚至可能是整个基因组的序列。这些序列中包含许多未知的基因,将基因从这些序列中找出来是基因组注释的主要内容。基因组DNA序列可分为两大部分:基因及其相关序列、基因间序列。以起始密码子开始、终止密码子结束、称之为开放阅读框(open readingframe,ORF)的序列为基因序列,它们可编码蛋白质和RNA(非编码RNA),所以又称为编码序列;基因相关序列包括拟(假)基因(pseudogene)、基因片段、内含子、非翻译区(untranslated region,UTR)等[1]。基因间序列主要是一些重复序列,它们是所有基因组尤其是真核生物基因组共同的重要特征。     

谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统优化

谷氨酸棒状杆菌作为重要的微生物细胞工厂,基因组修饰已经成为调节目标代谢物的首要途径。为了提高基因定点突变的编辑效率,建立了高效省时的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统。利用卡那霉素抗性作为筛选标记,构建了1株严谨的单链模式菌M-1,用于验证与统计编辑效率。首先,采用强启动子Ptuf,优化了切割效率;其次,利用重组酶Rec T和合理长度与添加量的ssDNA,优化了重组效率。实验结果显示:在启动子Ptuf和Rec T的双重作用下,采用滞后链(70 bp、12. 5μg)优化组合方式,使基因编辑效率提升至(80±5. 7)%。由Rec T介导的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统可在很大程度上加快谷氨酸棒状杆菌代谢工程改造。     

美国科学家成功绘制玉米“跳跃”基因

正日前,玉米"跳跃基因"被美国加利福尼亚大学戴维斯分校和冷泉港实验室的科研小组成功绘制。这一成果将最终有利于玉米的繁殖和生产。转座元件或转座子是可以移动基因组内位置("跳跃基因")的DNA序列。20世纪40年代诺贝尔奖得主遗传学家芭芭拉·麦克林托克(Barbara Mc Clintock)率先在玉米基因中发现它的     

乳腺特异性人α-乳白蛋白真核表达载体的构建

从正常人血液中提取人基因组DNA.以其为模板,扩增人α-乳白蛋白(α-LA)2.36kb的总DNA序列,经测序鉴定后,将其连接到PSV载体SV40启动子后.构建真核表达载体LA-DNA-psv.扩增牛XS1-酪蛋白5'调控序列约1.2kb的片段.测序鉴定.切去LA-DNA-psv栽体原来的SV40启动子,连接牛αS1-酪蛋白5'调控序列约1.2kb的片段为启动子,构建真核表达载体αS1-LA-DNA-psv.为在动物乳腺中特异高效表达人α-乳白蛋白做准备研究.     

日媒:日本首次收获运用基因组编辑技术的水稻

正据日媒报道,本月31日,日本农业和食品产业技术综合研究机构(茨城县筑波市)公开了运用"基因组编辑"技术改变基因并在室外栽培的水稻的收获情形。据该机构称,室外栽培经基因组编辑的植物在日本国内尚属首次。改变了控制水稻穗数和颗粒大小的基因,预计可以增加产量。     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7 CFU/100 mL时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌（英文）

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7CFU/100 m L时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

烟草基因组学研究方法篇:4.烟草分子标记技术及其应用

随着分子生物学的迅速发展,从DNA双螺旋结构的阐明,PCR技术的诞生,全基因组的测序,使分子标记技术从蛋白质水平向DNA分子水平逐步深化,DNA分子标记技术研究始于19世纪80年代,是指能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段,是DNA水平上遗传多态性的直接反映,是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的重要技术指标之一。     

浓香型白酒窖泥中细菌多样性的免培养技术分析

采用免培养(culture independent)技术直接从浓香型白酒窖泥中提取细菌微生物混合基因组DNA(也叫元基因组DNA),利用细菌16S rDNA通用引物扩增窖泥细菌的序列,根据16S rDNA序列对细菌多样性进行初步分析。采用PCR扩增技术、分子克隆技术以及序列同源性分析等方法测定细菌的16S rDNA,通过与基因数据库中相似菌群序列同源性的比较,得到样品菌种多样性,分别构建系统发育树。结果显示,细菌含有几大类群,表现出高度的细菌多样性。共分为Uncultured bacterium、Clostridium、Lactobacillus、Eubacterium和Syntroph-omonas五个细菌分类。     

高质量真姬菇全基因组提取方法筛选

食用菌细胞壁的复杂性增加了提取基因组的难度,为找到满足真姬菇全基因组序列分析的高质量基因组提取方法,分别使用氯仿-Tris法与CTAB-SDS法等12种方法提取真姬菇菌丝体基因组,并进行样品前处理的优化。经琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测定浓度和纯度、ITS序列的PCR扩增检测,结果表明:12种方法提取真姬菇菌丝体基因组时,氯仿-Tris法(样品烘干处理)与CTAB-SDS法(样本烘干处理)能得到较为完整的DNA。另外,通过在氯仿-Tris法(样品烘干处理)与CTAB-SDS法(样本烘干处理)的基础上增加柠檬酸钠-乙醇洗涤步骤,得到优化CTAB-SDS法。PCR检测结果显示,3种方法所得基因组DNA均能有效进行相应的酶反应。综合考虑基因组的浓度、纯度、完整性和有无降解等因素,优化CTAB-SDS法提取得到的基因组DNA(浓度为408.7 ng/μL,OD_(260)/OD_(280)为1.81±0.02)最适于真姬菇全基因组的序列分析。     

转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测 方法的建立

目的建立转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测方法。方法根据转基因苜蓿草品系J101 5’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物,建立了转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J101检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为80 pg,相当于50拷贝转基因苜蓿草J101基因组DNA。结论本研究建立的转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确地对转基因苜蓿草J101进行检测分析。     

转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J163品系特异性实时荧光(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测方法。方法利用Taq Man实时荧光PCR(real-time PCR)技术,根据转基因苜蓿草品系J163 5’端外源插入片段P-e FMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立了转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度及可重复性进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J163成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为15 pg,相当于9拷贝转基因苜蓿草J163基因组DNA,重复性试验显示,其标准偏差(Standard deviation,SD)和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均在可接受范围内。结论本研究建立的转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析。     

白平菇不同菌株菌丝体的RAPD分析及系统进化关系的研究

本研究采用RAPD技术分析白平菇四个不同株系的DNA序列多态性,用15个随机引物对菌株基因组DNA进行PCR扩增,其中3个引物可以扩增出较好的多态性条带图谱,共产生66条清晰稳定的带。通过对供试菌株遗传相似系数的计算和系统聚类分析,构建了树状聚类图谱,在分子水平上分析了白平菇的种质遗传学差异,为白平菇菌株鉴定提供快速有效的技术和方法。     

转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测 方法的建立

目的建立针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J163品系特异性等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。方法根据转基因苜蓿草品系J163 5’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计6条引物,建立了转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J163成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为16 pg,相当于10拷贝转基因苜蓿草J163基因组DNA。结论本研究建立的转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析。     

可视化LAMP法快速检测转基因苜蓿草J101品系

目的建立我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草J101品系特异性环介导等温扩增(loop–mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。方法根据转基因苜蓿草品系J101 3’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计6条引物,建立转基因苜蓿草J101品系特异性LAMP检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J101成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为16 pg,相当于10拷贝转基因苜蓿草J101基因组DNA。结论本研究建立的转基因苜蓿草J101品系特异性LAMP检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J101成分进行检测分析。