抗转铁蛋白受体鼠源性单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的　利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体。方法　从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA ,采用OligodT为逆转录引物 ,逆转录合成cDNA第一链 ,然后分别采用VL 和VH 框架区的PCR引物 ,扩增VH(重链可变区 )和VL(轻链可变区 )DNA片段 ,利用事先合成的存在于VL 下游引物和VH 上游引物的部分人工连接子重叠互补序列 ,将VL 和VH 的PCR回收产物进行部分重叠PCR(SOE) ,形成单链抗体基因。最后将此基因重组进表达载体pBAD gIII C中 ,经L arabinose(左旋阿拉伯糖 )诱导表达并初步鉴定。结果　构建出 70 0bp左右的单链基因 ,并获得阳性重组表达载体克隆 ,表达产物为相对分子质量 2 70 0 0左右的蛋白分子。结论　经因特网查询表明 ,单链抗体基因重链部分属于小鼠H链可变区ⅠA亚组 ;轻链属于小鼠κ轻链可变区Ⅱ亚组 ,此单链抗体基因的表达产物具有一定的特异结合活性。本研究为抗CD71单链抗体的临床应用打下了基础。     

CD25抗体轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

目的 获得抗人ＣＤ２５分子单抗的轻链及重链可变区基因,并进行序列分析。方法 采用ＲＴ－ ＰＣＲ,从ＷｕＴａｃ细胞总ＲＮＡ中扩增出轻链、重链可变区基因,进行克隆并作核苷酸序列分析。结果　构建的ＰＭＤ１８ －Ｔ－ＶＬ和ＰＭＤ１８－Ｔ－ＶＨ重组克隆载体,酶切与预期结果相符。ＶＨ和ＶＬ基因序列与鼠抗体的同源性大于 ８０％。克隆的重链可变区基因长度为３５１ｂｐ,属于鼠重链Ⅲ（Ｃ）亚类。轻链可变区基因长度为３２４ｂｐ,属于鼠轻链 Ⅳ 亚类。结论 本研究采用ＲＴ－ＰＣＴ法扩增出轻链及重链可变区基因,并进行了序列测定和分析,为进一步构建嵌 合抗体以及单链抗体奠定了基础。     

人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段噬菌体文库的初建

目的构建人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段(scFv)噬菌体文库。方法采用Trizol试剂提取尖吻蝮蛇咬伤后恢复期患者的外周血淋巴细胞的总RNA,用Oligotex誖mRNA Mini Kits纯化获得总mRNA,逆转录合成总cDNA,针对人抗体轻链和重链可变区基因设计一系列特异性引物,以合成的总cDNA为模板,扩增得到抗体轻链和重链可变区基因库,再通过重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)将轻链和重链拼接得到scFv文库;将scFv基因双酶切后,插入T7噬菌体骨架进行包装,以尖吻蝮蛇蛇毒蛋白抗原进行4轮淘选,建立蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,采用噬斑法检测scFv噬菌体文库滴度并进行PCR及测序鉴定。结果成功地将轻链和重链可变区基因库混合拼接得到scFv文库;经4轮淘选,蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库滴度为6.0×1014PFU/ml,抗体基因在噬菌体中表达的阳性率达50%以上,表达的scFv片段均为轻链和重链的杂合体,可较好的重现可变区的多样性。结论已成功构建了人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,为下一步噬菌体文库的克隆构建和筛选奠定了基础。     

重组人抗乙型肝炎病毒表面抗体的筛选及序列分析

目的克隆、筛选人抗乙型肝炎病毒表面抗体(抗-HBs),并对其基因序列进行分析。方法从抗-HBs抗体阳性血液中分离淋巴细胞,提取总RNA,合成cDNA,以此为模板,PCR扩增轻链和重链抗体可变区基因;应用已构建的抗体支架载体,构建重组表达载体,转化毕赤酵母X33,建立相应的酵母表达文库;甲醇诱导表达,Westernblot及ELISA筛选抗-HBs抗体阳性菌株;PCR扩增DNA片段,进行测序及Blastn比对,并与已发表的抗-HBs抗体序列进行同源性分析。结果重链及轻链抗体重组表达载体经双酶切鉴定,证明构建正确;经Westernblot及ELISA筛选,获得了具有HBsAg结合活性的完整轻重链抗体;轻链可变区与已发表序列核苷酸同源性为93%,而氨基酸同源性仅为88%,尤其CDR3变异较大;重链可变区与已发表序列同源性较低,CDR3区基因长度及序列均有较大差别。结论应用毕赤酵母表达体系筛选,获得了新的抗-HBs抗体。     

采用基因拼接方法构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库

目的　构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库。方法　从抗乙型肝炎病毒表面抗体高滴度 (1:10 2 4 )的人全血中分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,经RT PCR分别扩增出轻链可变区和重链可变区 ,再以噬菌体质粒为模板分别扩增出轻链恒定区 (Cκ)和重链恒定区 (CH1) ,将轻链可变区和轻链恒定区 (Cκ)及重链可变区和重链恒定区 (CH1)进行第 1次基因拼接 ,分别形成κ轻链和Fd重链 ,再以κ轻链和Fd重链作为模板进行第 2次基因拼接 ,形成完整的Fab基因 ,与pComb3H SS噬菌体质粒连接后 ,电穿孔转化大肠杆菌XL1 Blue。结果　通过多次电穿孔转化 ,获得总容量为 4× 10 5库容的噬菌体抗体库。结论　构建的Fab抗体库可用于筛选特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子     

抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达

目的构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定。方法分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人Ig G1重链恒定区基因连接,VL基因与人Ig G1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入p Opti VECTM-TOPO誖TA载体,轻链基因连入pc DNATM3.3-TOPO誖TA载体,构建重链表达质粒p Opti VEC-H和轻链表达质粒pc DNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经Mab Select Sure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数。结果鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长。嵌合表达载体p Opti VEC-H和pc DNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确。经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml。纯化的嵌合抗体纯度达99%以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L。结论成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力,为后续进行抗VEGF单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。     

抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素基因的克隆与表达

目的扩增抗癌胚抗原单链抗体(CEA-ScFv),与绿脓杆菌外毒素(PE40)进行重组及原核表达,旨在进一步研究重组蛋白CEA-ScFv-PFA0的靶向抗肿瘤作用。方法分别扩增抗癌胚抗原单链抗体的重链区、轻链区,用overlap PCR按照VH-VL的顺序连接,克隆至pMD18T载体中。再将VH-VL基因片段与含有.PE40的表达载体pET28a连接,转化B121(DE3),IPTG诱导表达。结果经DNA测序,其结果与设计完全相符。SDS-PAGE分析,在相对分子质量66000处可见明显表达带,表达量可占菌体蛋白总量的13％以上。免疫印迹表明重组蛋白具有PF40的抗原特异性。结论抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素的成功克隆与表达,为进一步研究其生物活性奠定基础。     

利用单个B细胞制备人源SARS-CoV-2刺突蛋白单克隆抗体

目的 利用单个B细胞制备人源严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突蛋白(S蛋白)单克隆抗体，并检测其中和活性。方法 采集经2次SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)免疫，且抗体水平较高的人静脉血，用人外周血淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，经偶联S蛋白的磁珠分选表达S蛋白抗体的单个B细胞。将单个B细胞反转录后，用套式PCR法扩增IgG重链、轻链可变区基因；通过重叠PCR法将可变区基因与CMV启动子及IgG leader序列DNA片段、IgG恒定区及PolyA序列DNA片段连接，构建抗体线性表达盒。将同一B细胞的重链、轻链线性表达盒转染HEK293T细胞，表达人源SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体。免疫荧光法检测抗体免疫反应活性，假病毒中和试验检测抗体中和活性。结果 共表达了26株SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体，经Western blot检测，于相对分子质量约55 000和25 ...     

抗CD_3单链抗体基因克隆与表达

采用重叠延伸拼接法 (SOE)连接抗CD3 抗体的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VK)基因 ,构建单链抗体基因 (ScFv)并将其克隆于含Tac启动子质粒中 ,用斑点杂交法筛选出重组子 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 )并诱导其表达     

抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

目的构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行瞬时表达。方法采用RT-PCR技术,设计针对信号肽的简并引物,钓取抗CD25杂交瘤细胞的重、轻链可变区基因,以质粒PAG4622为模板,钓取人抗体IgG1重、轻链恒定区基因,分别将重、轻链可变区基因与相应的恒定区基因进行拼接,将完整的重、轻链嵌合基因分别与真核表达载体pOptiVEC和pcDNA3.3连接,构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,将其通过脂质体法共转染至293T细胞中进行表达。通过RT-PCR法检测嵌合抗体基因的转录水平,ELISA法检测嵌合抗体的表达量,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合活性。结果抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒构建正确;RT-PCR显示嵌合抗体基因在293T细胞中成功转录;转染后48、72、96和120h,细胞培养上清中嵌合抗体的含量分别为7.47、11.72、8.02和18.28ng/ml;FCM检测其能特异性与IL-2Rα链结合。结论已成功构建了抗CD25人鼠嵌合抗体基因的真核表达质粒,并能在293T细胞中瞬时表达。     

抗犬瘟热病毒噬菌体抗体库的构建

目的构建抗犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)T7噬菌体单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库。方法用灭活CDV经皮下注射免疫犬,共3次,每次间隔2周,第3次免疫后2周采集犬外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,RT-PCR分别扩增犬IgG重链(heavy chain,VH)和轻链(light chain,VL)基因片段,通过SOE-PCR法将VH和VL用一段linker连接组装成scFv基因,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到表达载体T7 Select 10-3b上,用包装蛋白包装后,以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌进行增殖,随机挑取50个噬菌斑,进行PCR鉴定,并测定文库滴度。结果扩增的VH和VL基因大小均与预期相符,测序结果经blast比对,扩增的片段与犬IgG的VH和VL序列匹配率达90%以上;所构建的原始文库滴度为3.2×107pfu/ml,扩增后的文库滴度为5.0×108pfu/ml。对随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为94%。结论成功构建了抗CDV的T7噬菌体抗体库,为犬科动物犬瘟热的防治提供了参考。     

大容量人源天然噬菌体抗体库的构建

目的构建大容量(>108)的人源天然噬菌体抗体库。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,反转录出cDNA第一链,以此为模板,PCR扩增重链(VH)和轻链(VL)基因片段。将VL基因PCR产物插入含Loxp和Loxp511序列的pDF载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建轻链库,再将VH基因PCR产物插入轻链库载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建初级库。进一步用初级库超感染BS1365菌,使其VH与VL发生重组,获得重组库,再利用重组库感染大肠杆菌XL1-Blue,构建工作库。结果所有VH和VL亚类基因的扩增产物片段大小均与理论值相符,轻重链基因的克隆效率均为100%。初级库容量为108,滴度为6×1013;重组后的工作库有效容量为8×1010,滴度至少为1×1013。结论已构建容量为1010的人源天然噬菌体抗体库。     

人源核糖体展示单链抗体库的构建

目的构建人源核糖体展示单链抗体(scFV)库。方法从人外周血单个核细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以此为模板,设计多对具有简并性特点的引物,PCR扩增人免疫球蛋白重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在其两端加上核糖体展示所需元件,并通过重叠PCR法将VH和VL经(Gly4Ser)3短肽连接成单链抗体,构建核糖体展示库。结果利用不同引物进行PCR时,绝大多数引物能扩增出300～400 bp的VH和VL片段;通过大引物扩增成功加上了核糖体展示所需元件,重叠PCR体外连接成约900 bp大小的scFv基因,大量扩增得到核糖体展示库。结论已成功构建了人源核糖体展示scFv库,为人源抗体药物的开发奠定了基础。     

抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选

目的构建多样性良好的抗白念珠菌人源性单链抗体库,筛选抗白念珠菌特异性的噬菌体抗体。方法从20份人外周血淋巴细胞(包括正常成年人5份、新生儿5份和白念珠菌感染恢复期患者10份)中提取总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增人抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,以重叠延伸PCR法将VH和VL拼接成scFv基因,克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建人源抗白念珠菌天然噬菌体抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果构建的人源性抗白念珠菌天然噬菌体抗体库库容为2.8×109,多样性良好。共筛选出18个阳性克隆。结论已成功构建了1个多样性良好的抗白念珠菌人源性噬菌体抗体库,为筛选有效治疗白念珠菌和耐药性白念珠菌感染的药物提供了条件。     

抗人ICAM-1单链抗体表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单链抗体(ScFv)的表达载体,并在大肠肝菌中表达。方法从分泌ICAM-1单抗的杂交瘤细胞中提取RNA,用RT-PCR扩增抗体VH和VL基因,重叠延伸PCR扩增人ICAM-1-ScFv基因,将其连接到pET-22b(+)载体上,转化大肠杆菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,表达产物纯化及复性后,检测特异性及活性。结果序列分析表明抗ICAM-1 ScFv基因全长为744bp,编码247个氨基酸,其中含357bp的VH基因片段和342bp的VL基因片段。表达蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的32%。经变性和复性后,纯度达80%以上,复性率达25%。Western blot和ELISA检测,ScFv均可与ICAM-1抗原特异性结合。细胞黏附试验表明ScFv能抑制ICAM-1与HSB2细胞间的黏附,其作用稍弱于亲本mAb。结论已成功构建了抗人ICAM-1的ScFv表达载体,其表达产物具有抗体特异性和活性。     

治疗用抗人T淋巴细胞分化抗原单克隆抗体与人体组织反应性的体外研究

应用免疫组化酶染色法及免疫细胞荧光染色法体外检测了 WuT_3(抗 CD_3),WuT_4(抗CD_4),WuT_8(抗 CD_8),WuT_9(抗 CD_71 或 TfR),WuTac(抗 CD_(25)或 IL-2R)等5种临床治疗用小鼠抗人 T 淋巴细胞分化抗原单克隆抗体(简称单抗)与25种正常人体组织的反应性。结果显示,WuT_3与髓质胸腺细胞,淋巴结及扁桃体中 T 细胞区细胞,脾白髓中动脉周围淋巴鞘细胞及胃肠道粘膜层淋巴细胞呈阳性反应。WuT_4与皮质胸细胞及大多数髓质胸腺细胞呈阳性反应。WuT_8与皮质胸腺细胞及少数髓质胸腺细胞呈阳性反应。WuT_4 和 WuT_8阳性细胞在淋巴结、扁桃体、脾脏及胃肠道粘膜中的分布与 WuT_3 阳性细胞基本一致,但数量依次减少。淋巴结和扁桃体的生发中心以及脾脏的脾小结中散在分布有少数WuT_3,WuT4及 WuT_8阳性细胞。此外,睾丸中散在分布个别 WuT_8阳性淋巴细胞。WuT_9与26%的骨髓细胞及个别皮质胸腺细胞呈阳性反应。WuT_9 尚与小肠粘膜肠腺底部细胞呈较强染色。WuTac 仅与个别散在的髓质胸腺细胞呈阳性反应。上述5种单抗与其它非淋巴组织及细胞基本呈阴性反应。