牛乳中主要过敏原的分离纯化研究进展

牛乳中含有3 种主要的过敏原蛋白：酪蛋白、β- 乳球蛋白和α- 乳白蛋白。本文详细叙述沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、羟基磷灰石层析法、疏水相互作用层析法、高效液相色谱法以及膜技术等分离纯化技术在牛乳主要过敏原分离纯化中的研究进展。其中,离子交换层析与凝胶层析已被广泛使用,而沉淀法一般作为粗提纯过的步骤。羟基磷灰石层析与疏水相互作用层析法也较为常见,既可单独分离过敏原,又可与其他方法结合来分离过敏原。另外高效液相色谱法与膜技术则是进一步纯化的后续工作,以提高过敏原的纯度。     

两种分离β-乳球蛋白方法的比较

以乳清粉为原料,比较研究了硫酸铵沉淀加凝胶层析法和高盐低pH加透析法两种技术路线分离纯化β-乳球蛋白的得率与纯度.实验结果表明,高盐低pH加透析法所得β-乳球蛋白浓度为11ms/mL、SDS-PAGE检测纯度达90%以上;硫酸铵沉淀加凝胶层析法所得β-乳球蛋白浓度为1mg/mL、纯度>90%.     

牛乳过敏原β-乳球蛋白检测方法的研究进展

目的食物过敏已成为全球性的食品安全问题,欧美等发达国家均要求对食品中的过敏原成分进行标识,其中就包括作为八大过敏性食物之一的牛乳及其乳制品。β-乳球蛋白是牛乳中的主要过敏原,约占乳清蛋白的50%,牛乳总蛋白的10%,并且约有82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏,因此其可以作为检测食品中是否含牛乳蛋白的一个有效的标志物。建立灵敏、可靠的β-乳球蛋白检测方法,对牛乳过敏原标识及保障牛乳过敏人群的安全消费具有重要意义。本文主要综述了牛乳β-乳球蛋白的高效液相色谱法、超高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附法、免疫层析法、电化学免疫法、蛋白微阵列法、等离子体共振法等色谱学和免疫学检测方法的研究进展,并对未来发展方向作出展望,以期促进牛乳β-乳球蛋白等过敏原检测方法的研究与开发。     

β-乳球蛋白IgE抗原决定簇的识别

以β- 乳球蛋白氨基酸序列为模板,错位合成β- 乳球蛋白多肽,以收集到的牛乳过敏患者血清为抗体,鉴定β- 乳球蛋白IgE 抗原决定簇,分析影响致敏性的关键氨基酸,探讨牛乳过敏机理。结果表明：β- 乳球蛋白IgE抗原决定簇有4 条,氨基酸序列分别为17～31、72～86、92～106、152～166,并且苏氨酸(AA20)、蛋氨酸(AA23)、天冬氨酸(AA27)是影响β- 乳球蛋白致敏性的关键氨基酸。说明特异性水解抗原决定簇或定点修饰氨基酸可以实现过敏原脱敏的目的。     

牛奶过敏原表位研究进展

详细地综述了牛乳酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白的过敏原B细胞表位以及T细胞表位的研究进展,介绍了牛乳过敏原之间构象性表位的相似形以及线性表位序列位置的特异性,同时也简述了牛乳过敏原表位定位的方法及表位定位的应用。     

牛乳过敏原β-乳球蛋白分离纯化方法优化及IgG结合能力分析

目的 优化分离纯化方法,获得高纯度、高得率且具有良好IgG结合能力的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-Lg)。方法 以超速离心脱脂、等电点沉淀、硫酸铵沉淀为前处理方法,通过Sephadex G-75凝胶柱层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析纯化β-Lg,并对纯化条件进行优化,结合SDS-PAGE与LC-MS/MS对β-Lg进行鉴定,采用Western blot对其IgG结合能力进行验证。结果 凝胶层析最佳洗脱条件为0.02 mol/L pH 6.8 Tris-HCl+0.15 mol/L NaCl,流速0.4 mL/min;阴离子交换层析最佳洗脱条件为0.05 mol/L pH 6.5 Tris-HCl+0~0.5 mol/L NaCl,流速0.5 mL/min;结合SDS-PAGE与LC-MS/MS鉴定,该条件下获得的终产物为β-Lg;该方法获得的β-Lg得率为54.89%,纯度为100%(SDS-PAGE),且具有良好的IgG结合能力。结论 本研究建立了一种简单、可重复的β-Lg分离纯化方法,在获得高纯度β-Lg的同时保持良好的IgG结合能力,为后续牛乳过敏及脱敏研究提供技术支撑。     

牛乳中主要过敏原组分的分离纯化及鉴定

目的:分离纯化并鉴定牛乳中引起过敏反应的主要致敏组分。方法:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分析了脱脂乳和乳清的蛋白组分,用饱和硫酸铵分段盐析-DEAE离子交换柱层析纯化过敏原蛋白,脱脂乳和乳清蛋白皮下注射Balb/c小鼠获得高效价特异性IgE抗血清用于免疫印迹分析。结果:免疫印迹分析显示β-乳球蛋白(β-Lg)是引起牛乳过敏的主要过敏原,建立了牛乳过敏小鼠模型。结论:明确了牛乳过敏的主要过敏组分,对牛乳过敏症的诊断治疗以及无过敏原牛乳的制备提供了实验依据。     

脱盐牛乳乳清粉中β-乳球蛋白的分离纯化

结合硫酸铵分级盐析、阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析三种方法,从牛乳乳清蛋白中分离、提纯出β-乳球蛋白。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白成分,结果显示:1在质量分数为75%盐析段与其他成分相比含有较多的β-乳球蛋白;2用阴离子交换层析进行进一步的分离,经过两次的阴离子交换层析可得到较高纯度的β-乳球蛋白;3再用Sephadex G-10凝胶层析,电泳结果显示只有一条带,并与β-乳球蛋白标准品(纯度95%)带一致,得到高纯度的β-乳球蛋白。     

牛乳中主要蛋白过敏原研究现状

牛乳蛋白过敏原的研究成为近几年国内外的研究热点之一.依据有关牛乳中过敏原的研究报道.对牛乳中的主要过敏原酪蛋白、B-乳球蛋白(p-LG)及á一乳白蛋白(á-LA)的结构特征、表位、改性等的研究现状进行介绍,并对牛乳蛋白过敏原的研究进行展望.     

中国水牛乳中α-乳白蛋白活性分离方法比较

以水牛乳为原料,离心分离脂肪,再采用等电点缓慢酸沉去除酪蛋白,结合铁盐沉淀法和钙盐沉淀法两种方法分别对乳清蛋白中α-乳白蛋白进行活性分离,在保证α-乳白蛋白分离纯度的同时,对其活性和得率分析检测.结果显示,铁盐沉淀法分离α-乳白蛋白时,在pH4.5～4.7的酸性条件下采用质量分数0.04％的铁盐分离α-乳白蛋白保证α-乳白蛋白纯度达到电泳纯的同时,其活性比例和得率分别达到44.68％和21.06％;而在pH7.0的中性条件下采用质量分数0.005％的铁盐分离α-乳白蛋白也可保证α-乳白蛋白的纯度达到电泳纯,此时,其活性比例和得率分别达到64.00％和13.23％.钙盐沉淀法可很好地保持α-乳白蛋白的活性,但分离纯度过低.     

One-step method for the isolation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin from cow’s milk while preserving their antigenicity

Milk is a highly nutritional food, and separation of major allergens from milk has become important to people who are allergic. The aim of this study was to establish a simple and repeatable method for the isolation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin from cow’s milk while preserving their antigenicity. Fractions of α-lactalbumin and β-lactoglobulin were salted-out using 50% ammonium sulfate from whey that was collected from cow’s milk after pH adjustment and then purified by anion-exchange chromatography with diethylaminoethyl-Sepharose Fast Flow. The antigenicity of the purified proteins was evaluated by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that the purities of the α-lactalbumin and β-lactoglobulin collected were 84.85 and 94.91% and the cross-reactivities of the purified proteins were 93.2 and 95.4%, respectively. Therefore, this simple and efficient strategy consisting of a one-step process for α-lactalbumin and β-lactoglobulin is suitable for purifying the major allergens in cow’s milk. In addition, a scientific experimental basis for the preparation of non-allergenic milk was also offered in this study.     

牛奶替代品致敏性的识别

为找到牛奶替代资源,以牛奶过敏患者血清为探针,识别牛奶及其制品过敏原,并鉴别山羊奶、水牛奶、驴奶蛋白与牛奶过敏患者血清交叉反应性。结果表明,β - 乳球蛋白和a- 酪蛋白为牛奶主要过敏原,山羊奶、驴奶总蛋白IgE 结合能力低于牛奶,二者可以作为牛奶替代资源。     

牛乳清蛋白中β-乳球蛋白的分离纯化

结合硫酸铵分段盐析和凝胶层析两种方法,从牛乳乳清蛋白中分离、提纯出β-乳球蛋白。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白成分,结果显示:①在20%～30%、70%～80%盐析段只有两条带,分别是β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白带,得到较纯的蛋白;②再用SephadexG-50凝胶过滤层析,电泳结果显示只有一条带,并与标准β-乳球蛋白带一致,得到较纯的β-乳球蛋白。     

毛细管电泳法对乳及乳制品中真蛋白的测定

利用毛细管电泳法对市售乳清蛋白粉、采自当地奶牛场的牛初乳及原料奶、同一品牌不同阶段或同一阶段内不同厂家、不同国别的婴儿配方奶粉、不同保质期的液态奶、不同国别的超高温灭菌(UHT)奶和酸奶、国产复原乳中α- 乳白蛋白(α-Lac)、β- 乳球蛋白A (β-LgA)及β- 乳球蛋白B (β-LgB)的质量分数进行测定。结果表明：α-Lac、β-LgA 及β-LgB 的质量分数在乳清蛋白粉、牛初乳及原料奶中依次降低。液态奶中上述3 种蛋白的质量分数与保质期有关,一般保质期越久的产品,上述3 种蛋白的质量分数越低。大多数酸奶中α-Lac 的质量分数均高于UHT 奶。婴儿配方奶粉中α-Lac 质量分数随着阶段数的增加而增加,而且同一阶段内不同厂家不同国别配方奶粉中α-Lac 质量分数差异也较大,并非进口奶粉中α-Lac 质量分数均比国产奶粉高。     

牛奶过敏原制备方法的研究和免疫活性鉴别

目的探索牛奶主要过敏原的制备工艺。方法采用等电点沉淀、凝胶层析和分子筛等技术纯化牛奶中主要过敏原组分;采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,采用双抗原夹心-ELISA鉴定免疫活性。结果成功获得牛奶中的四种主要过敏原组分:酪蛋白、β乳球蛋白、α乳白蛋白和分子量较高的P1组分,并经过免疫实验证实这四种组分均能与过敏血清产生反应,而其中β乳球蛋白和P1组分反应性较高。结论本研究探索出一种简单、实用的牛奶主要过敏原制备工艺,并证实牛奶中的β乳球蛋白和高分子量蛋白质为主要过敏原。     

阴离子交换层析法分离纯化花生主要过敏原Ara h1的研究

Ara h1蛋白是花生的主要过敏原蛋白。本研究从天然的花生提取花生蛋白质,通过硫酸铵分级沉淀及阴离子交换层析法纯化花生主要过敏原Ara h1。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白纯度,结合免疫印迹实验对Ara h1免疫活性进行鉴定。结果表明：采用阴离子交换层析法纯化出的Ara h1纯度达到90%以上。得率为23.1%。免疫印迹实验表明,此方法纯化出来的Ara h1仍具有免疫原性,能跟花生过敏病人血清特异结合。     

糖基化修饰牛乳清蛋白过敏原性研究进展

牛乳含有丰富的营养物质,是除母乳外婴儿最理想的食品来源。但是,部分婴儿对牛乳会产生过敏反应。通过美拉德反应对乳清蛋白进行糖基化改性是一种比较新的方法,但已经成为食品中研究的热点。本文对牛乳中主要过敏原的结构特征、致敏性、表位等进行阐述,详细地介绍乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白糖基化改性的国内外研究进展。糖基化法作为降低乳清蛋白致敏性的方法之一,能较好地保持其原有结构和功能特性。     

间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白含量的准确性评价

研究建立了以β-乳球蛋白标准品为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG:HRP为二抗、邻苯二胺为底物的间接竞争酶联免疫检测法(indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent,ELISA)。同时以反相高效液相色谱法定量检测相同样品中β-乳球蛋白含量,采用t检验方法来评价间接竞争ELISA的方法定量检测β-乳球蛋白的准确性。t检验方法结果显示:在显著水平α=0.05下,该间接竞争ELISA法检测β-乳球蛋白的测量值较为准确。