非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

牛透明质酸酶PH-20核心区在毕赤酵母中的高效表达

目的利用毕赤酵母表达牛源透明质酸酶核心区,以实现透明质酸酶的重组制备。方法将去除信号肽和锚定区域的牛源透明质酸酶PH-20成熟肽编码序列按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化,然后连入pPICZaA表达载体并转入毕赤酵母SMD1168H菌株。0.5%（v/v）甲醇诱导表达72 h后采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid,DNS）法测定培养液上清中透明质酸酶活性。结果包含PH-20核心序列（1332 bp）的重组酵母经甲醇诱导表达72 h,培养液上清中透明质酸酶活性达135.2 U/mL。结论实现了牛源透明质酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达。     

菊糖果糖转移酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

将PCR获得的不包含信号肽序列的菊糖果糖转移酶基因(ift)与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建重组载体pPIC9 K-IFTase.重组载体经线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性梯度筛选及PCR鉴定,获得一株高拷贝菊糖果糖转移酶重组毕赤酵母菌株.该重组菌株经甲醇诱导,能够分泌具有活性的菊糖果糖转移酶,且60h时酶活为10.3U/mL.结果表明,菊糖果糖转移酶可以实现在毕赤酵母的分泌表达.     

密码子优化及透明颤菌血红蛋白共表达提高耐热脂肪酶在毕赤酵母的表达

根据毕赤酵母密码子的偏好性,通过在线软件对Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb）进行密码子优化。优化后的脂肪酶基因（tll-opt）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb-opt）中碱基GC含量分别由原来的46%提高到49%和42%提高到51%,碱基A、T、C、G均匀分布,减少了AT和GC富集区,利于tll-opt和vhb-opt基因在毕赤酵母X33中的表达。将tll和tll-opt连接到表达载体pPICZαA并转入毕赤酵母X33中。摇瓶培养条件下,含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为7 U/mL和16 U/mL。50 L发酵罐培养条件下,含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为201 U/mL和430 U/mL。为了进一步提高含tll-opt重组工程菌的表达酶活性,将vhb-opt转入该重组工程菌得到工程菌VHb＋（含有tll-opt和vhb-opt）。重组工程菌VHb＋在摇瓶培养条件下最大酶活力为23 U/mL,分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.39 倍和3.28 倍。重组工程菌VHb＋在50 L发酵罐瓶培养条件下最大酶活力为610 U/mL,分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.41 倍和3.03 倍。     

重组嗜热乳糖酶在毕赤酵母中的表达、纯化与活性分析

为获得耐高温的重组乳糖酶,PCR扩增激烈热球菌(Pyrococcus furious)乳糖酶基因、构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/Lac并转化毕赤酵母X-33菌株。重组酵母转化子经甲醇诱导,重组嗜热乳糖酶实现了分泌表达并经蛋白印迹验证。纯化前上清液中乳糖酶总活力高达125 U/mL,经镍亲合纯化得重组酶,SDS-PAGE显示其纯度在95%以上,比活力1 800 U/mg,该酶最适温度在105℃左右且热稳定性好,具有很强的水解乳糖能力。     

康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在毕赤酵母中的表达研究

在毕赤酵母中表达康氏木霉(Trichoderma koningii)纤维素酶基因cbhI。提取经诱导的康氏木霉mRNA,通过反转录及PCR反应扩增纤维素酶cbhI基因cDNA。将cbhI基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,采用电激法将经SacⅠ线性化的重组质粒pPICZαA-cbhI转化毕赤酵母GS115,MD及G418抗性平板筛选cbhI基因高拷贝转化子,并用PCR鉴定转化子。BMMY培养基中加入0.5%甲醇对毕赤酵母进行纤维素酶CBHI诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示,表达的重组蛋白相对分子质量约67 kD,pNPC酶活为24.1 U/L,酶蛋白量为0.22 mg/mL,表明,康氏木霉cbhI可以在毕赤酵母中表达,并具有较高活性。     

溶菌酶LyAa在黑曲霉中的高效表达与酶学性质分析

该研究探讨了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后,构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达,利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具,使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2 291.37 U/mL,是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力（869.74 U/mL）的2.63倍,是仅使用传统单拷贝表达载体的LyAa-T菌株酶活力（358.41 U/mL）的6.39倍。通过6×His标签使用镍柱亲和层析成功纯化了重组溶菌酶LyAa,并对其酶学性质进行了分析。溶菌酶LyAa蛋白大小约为25.0 ku,最适pH值为4.0,最适温度为30 ℃,并显示出良好的胃蛋白酶稳定性。综上,该研究基于双拷贝载体和CRISPR技术成功优化和提高了溶菌酶在黑曲霉中的表达。     

重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化

该研究以甲醇诱导型重组毕赤酵母（Pichia pastoris） NCY-2为研究菌株,在摇瓶水平上首先考察了诱导时间、甲醇含量、诱导pH及诱导温度对蛋清溶菌酶表达的影响,然后通过正交试验设计优化出了该菌株的最佳发酵条件,并进一步研究了摇瓶发酵过程中的菌体生长和酶活力随时间的变化规律。研究结果表明,蛋清溶菌酶的最适诱导时间为96 h,甲醇含量为2%,诱导pH值为3.5,诱导温度为20 ℃;在此条件下发酵液的蛋清溶菌酶酶活力达到775 U/mL,是优化前的2.2倍。 关键词：中图分类号：Q815 文章编号：0254-5071（20１7）02-0054-04 doi：     

耐热赖氨酸氨肽酶毕赤酵母表达及培养条件优化

为实现耐热耐氨酸氨肽酶的异源表达,通过PCR扩增技术从Pseudomonas aeruginosa NJ-814基因组中克隆获得耐热的赖氨肽酶基因(PLAP),构建重组载体p PIC9K-PLAP,并最终实现在毕赤酵母GS115中的分泌表达。对重组毕赤酵母进行初步筛选,单因素实验优化获得重组毕赤酵母最佳诱导条件如下:诱导培养基初始pH为5.0、甲醇质量浓度1.5 g/dL、诱导温度28℃、装液量25 mL/250 mL、Co~(2+)浓度50μmol/mL、山梨醇添加量9 g/L。在最优条件下,氨肽酶酶活提高了5.2倍,比酶活2.74 U/mg。实验结果表明:PLAP基因已成功转入毕赤酵母GS115并获得表达。     

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。     

粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆及在毕赤酵母中的初步表达

采用连续延伸PCR方法克隆到粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）漆酶基因，并将其克隆到表达载体pPIC9k，重组质粒经线性化、电激转化Pichia pastoris KM71，部分阳性克隆的PCR结果表明：漆酶基因已整合到巴斯德毕赤酵母染色体上，重组菌经甲醇诱导后3～5d产漆酶量最高，为2-3U／mL。     

基于组合优化策略在毕赤酵母中高效表达杜邦嗜热菌脂肪酶北大核心CSCD

杜邦嗜热菌脂肪酶(LIP1)是一种在洗涤行业、生物柴油制备、油脂改性等领域具有良好应用潜力的碱性脂肪酶,然而其天然产量极低,难以满足产业化需求。采用组合优化策略筛选出高效表达LIP1的毕赤酵母重组菌株。首先,构建毕赤酵母密码子偏好性优化的LIP1基因,通过高浓度G418抗性平板和BMMY-罗丹明B定性平板筛选出脂肪酶活性较高的重组菌株;其次,利用信号肽优化和分子伴侣共表达优化筛选得到一株高效表达的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1,采用碱滴定法测定其酶活,采用比色法测定其底物特异性。结果表明,经组合优化策略筛选出的菌株在摇瓶和5 L发酵罐中发酵最高分泌酶活分别达到1 136 U/mL和12 150 U/mL。底物特异性结果显示重组脂肪酶LIP1最适底物为C8链长的对硝基苯酚酯。综上所述,基于组合优化策略实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达,为未来LIP1的产业化奠定基础。     

18S rDNA介导的桔青霉核酸酶P1表达载体的构建及表达分析

本研究采用黑曲霉Bdel4菌株为宿主菌,敲除gla A,aam A,An05g02100和An12g06930四个主要的胞外分泌蛋白,为核酸酶P1的表达和分泌提供通路。通过PCR扩增得到黑曲霉Bdel4的r DNA序列,构建了以r DNA序列为整合位点的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S,将构建的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S转入黑曲霉Bdel4。通过半荧光定量PCR进行转化子初筛,之后测定核酸酶P1的酶活复筛,选出一株高活性菌株用于工业生产。采用SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因nucP1的总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数,探究其与酶活表达水平之间的联系。结果显示含9个nuc P1基因拷贝数的菌株的酶活水平达到88.5 U/mL,较核酸酶P1单拷贝菌株增加了3.86倍,较之前研究中异源表达核酸酶产量提高1.20倍,再增加nuc P1的拷贝数时,酶活水平随着拷贝数的增加而降低。     

基因重组毕赤酵母产蛋清溶菌酶发酵工艺及表达条件的优化

以甲醇诱导型蛋清溶菌酶基因重组毕赤酵母（Pichia pastoris）NCY-2为研究菌株,选用麦芽汁为培养基,首先通过单因素试验,对培养基锥形瓶种类、原麦芽汁稀释度及外加氮源进行了优化,在此基础上,采用均匀设计试验,得到菌株NCY-2的最佳发酵工艺条件为发酵温度31 ℃、pH 5.5,转速220 r/min,接种量4%;蛋清溶菌酶最佳表达条件为诱导温度18 ℃、诱导pH 4.4、转速190 r/min、甲醇初始添加量为0.3%（之后每隔24 h分别添加体积分数1.0%、1.5%、2.0%,诱导72 h结束）。在此优化条件下,摇床水平发酵液中蛋清溶菌酶酶活力可达到962.4 U/mL。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115中的异源表达

目的构建毕赤酵母基因工程菌,以实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。方法人工合成朱黄青霉HI-4的α-1,6-葡聚糖酶基因ZHdex,克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电转入毕赤酵母GS115。甲醇诱导目的蛋白表达。结果成功在毕赤酵母GS115中对ZHdex基因进行表达,SDS-PAGE表明重组毕赤酵母在66×103附近有目的蛋白表达,与理论值一致。在摇瓶水平,甲醇诱导培养120 h后,α-1,6-葡聚糖酶的最高酶活达28.79 U/mL,蛋白质浓度为0.56 mg/mL。结论获得一株重组毕赤酵母GS115-ZHdex,其产物具备α-1,6-葡聚糖酶活性,成功地实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。     

过敏原肌质钙结合蛋白在毕赤酵母中的表达、优化及免疫反应性研究

目的 探究天然肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein, SCP)的可替代物,为蟹类过敏原的检测提供基础材料,本研究首次利用毕赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)高效表达表达三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)重要过敏原SCP,并检验其免疫反应性。方法 根据毕赤酵母的密码子偏好性优化SCP基因并构建重组质粒。将其热激转化至P. pastoris GS115菌株后经遗传霉素(Geneticin, G418)筛选获得阳性高拷贝子。最后通过甲醇诱导表达重组SCP并结合免疫印记(Western blotting, WB)和间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)验证其免疫反应性。结果 SCP在P. pastoris GS115中实现了可溶性高效表达,其表观分子量约为28 kDa。在摇瓶水平下,最佳诱导条件为pH为6.0、每24 h添加1.0%(v/v)甲醇,于28℃发酵144 h,在此条件下,纯度为91.6%的SCP产量可达15 mg/L。WB和间接ELISA结果表明,重组SCP具有IgG结合能力。结论 毕赤酵母表达系统可以得到纯度较高且免疫反应性良好的重组SCP。本研究为SCP的理化研究及产业化应用奠定了基础,并有望促进特异性甲壳类过敏原检测的发展。     

棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

以右旋糖酐酶产生菌棘孢青霉F1001基因组为模板反转录合成右旋糖酐酶的cDNA（dex）,基因全长1 866 bp,根据毕赤酵母密码子偏好性优化dex序列获得优化右旋糖酐酶基因（opt-dex）,分别构建dex-pPICZαA和opt-dex-pPICZαA重组质粒,电击转入毕赤酵母X33中构建重组子。通过蓝色右旋糖酐T-2000平板以及摇瓶发酵筛选获得产右旋糖酐酶的重组酵母菌株。重组酶的酶学性质分析显示,重组酶分子质量65?kDa、最适pH?5.0、最适温度35?℃,专一作用于α-1,6糖苷键。在摇瓶水平上对重组毕赤酵母表达条件进行优化,优化培养条件为培养温度25?℃、初始pH?5.0、每24?h甲醇添加量1%（体积分数）、每24?h山梨醇添加量5?g/L、吐温-80添加量4?g/L、摇瓶装液量50?mL/500?mL锥形瓶,优化后的重组右旋糖酐酶分泌表达酶活力提高到240.74?U/mL。重组酵母X33是一株适合外源表达棘孢青霉右旋糖酐酶基因的工程菌,该重组酶可替代棘孢青霉右旋糖酐酶直接应用于工业生产催化制备右旋糖酐。