鲢鱼卵高分子质量CPI-I 的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)的粗提浓缩液,进而经Q Sepharose Fast Flow阴离子层析和Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化了的CPI-I。以偶氮酪蛋白(azocasein)法监测粗提液及层析纯化中CPIs的抑制活性。层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)法监测洗脱物的CPIs抑制活性的热稳定性。最终鲢鱼卵CPI-I被纯化了72倍,酶回收率为10.25%。利用Sephacryl S-200分子筛层析Marker标准曲线以及反相酶谱法,初步判断CPI-I的分子质量为89kD。高碘酸-Schiff试剂(PAS)染色法证明该蛋白为糖蛋白。CPI-I能够抑制鲢鱼组织蛋白酶L,且具有显著的热稳定性。     

鲢鱼卵中低分子CPIs的纯化鉴定及改善鱼糜凝胶强度的效果研究

通过比较鲢鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors,CPIs）粗提过程中的比活力（Azocasein法）,确定其最佳粗提条件为：以含0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）的20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）作为匀浆缓冲液,并于30 ℃对匀浆样进行pH 3.0酸处理10 min,然后碱回调至pH 8.0,CPIs纯度提高了15.54 倍。进一步经SP Sepharose Fast Flow阳离子层析验证表明,与pH 4.0相比,pH 3.0酸处理能高效除去活性峰Ⅱ中的酸碱及热不稳定杂蛋白,使CPIs比活力提高了48.22 倍。采用SephacrylS-200分子筛层析,获得部分纯化的低分子CPIs组分Ⅱ-b和Ⅱ-c,比活力和纯化倍数分别为1 098.59 U/mg、312.10 倍和1 769.23 U/mg、502.62 倍。电泳分析表明,明胶底物-SDS-反相酶谱法无法鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c的抑制活性;而与木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）则初步鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c中均含有至少7 kD和10 kD两种低分子CPIs。最后经质构分析表明,Ⅱ-b和Ⅱ-c以5 U/g添加入鲢鱼鱼糜时,均能够极显著提高鲢鱼鱼糜凝胶强度（48.77%和55.55%）,抑制软化。     

鲢鱼和草鱼下脚料中CPIs抑制活性比较及其分子量分布的鉴定

本研究首先确定偶氮酪蛋白（Azocasein）法和荧光合成肽法测定CPIs抑制活性的适宜反应体系,并证实Azocasein法更适合在鲢、草鱼下脚料（卵、皮）粗提过程中监测CPIs的抑制活性,而在层析过程中需采用高灵敏度的荧光合成肽法。Azocasein法测定表明,草鱼卵（349600units、332units/mg）和皮（25600units、87units/mg）中总活和比活均分别显著高于鲢鱼卵（10620units、3.98units/mg）和皮（3726units、14.14units/mg）;同时,草鱼卵中CPIs抑制总活、比活均高于皮;鲢鱼卵中CPIs抑制总活高于皮,但抑制比活则低于皮;此外,根据Sephacryl S-200分子筛层析中活性峰位置,初步判断两种鱼卵和皮组织中均存在高（50¹28ku）、低（7¹9ku）分子量形式的CPIs,但明胶底物-SDS-PAGE反相酶谱中仅可见高分子CPIs形成的条带,而小于20ku的低分子CPIs均无法得到鉴定。      

鲢鱼肝脏中高分子CPIs提取方法的建立及其鉴定

研究了不同浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)、热处理条件及pH值对鲢鱼肝脏中高分子半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)提取过程中的作用,根据其对CPIs在TSK液相上高分子质量部分的蛋白峰值和比活力(荧光合成肽底物法)的影响,确定了最佳粗提条件为:以含5 mmol/L的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),100mmol/L的Tris,3 mmol/L的EDTA(pH 7.5)作为提取缓冲液,而后在pH 8.7碱处理条件下经90℃加热5 min后,再回调到pH 7.0。用该法制备的鲢鱼肝脏CPIs粗提物经制备型Sephacryl S-200分子筛层析,分离得到的高分子活性部分,进一步经过反相酶谱法鉴定得到一种高相对分子质量的活性CPI,推测其可能是与某些蛋白结合形成了复合物,或是高分子CPIs的二聚体形式。     

鲢鱼CPIs的三种电泳鉴定方法的比较研究

本文对Geltain-substrate-SDS-PAGE反相酶谱法（方法 A）、Native-PAGE反相酶谱法（方法 B）和与papain反应后进行SDS-PAGE法（方法 C）三种电泳方法的鉴定效果、灵敏度进行了对比,确定了鲢鱼卵粗提样中小分子CPIs的最适电泳鉴定方法。结果表明,对于在电泳上活性不稳定的鲢鱼卵小分子CPIs而言,方法 A灵敏度较低,且可能出现假阳性现象;方法 B虽能准确鉴定小分子CPIs的存在,但不能判断分子量。方法 C,即小分子CPIs与papain在37℃下反应5h以上,然后进行SDS-PAGE,抑制剂条带清晰可见,鉴定效果好,且能提供分子量分布信息。此外,尽管荧光底物法和Azocasein法都无法检测到鲢鱼肝胰浓缩粗提液中半胱氨酸蛋白酶抑制活性,但是利用C法,则有效地鉴定了其中CPIs的存在和分子量分布情况。综上所述,方法 C或协同方法 B的电泳鉴定方法,适用于鲢鱼下脚料粗提样品中CPIs的鉴定,效果理想,灵敏度高,操作简便。      

猪血浆半胱氨酸蛋白酶抑制肽的筛选及其机制

本研究对猪血浆中半胱氨酸蛋白酶抑制肽进行了制备筛选,并对其抑制动力学和作用机制进行了研究。通过胰蛋白酶酶解制备的猪血浆多肽中,分子量在0～3 kDa的多肽组分抑制率为35.15%,其抑制活性最高;利用UPLC-Q-TOF联用质谱鉴定,从猪血浆多肽组分中鉴定多肽氨基酸序列,分析得到的多肽氨基酸序列有35条,根据目标蛋白来源和细胞定位,选择其中两条氨基酸序列,并命名其为PP1、PP2,PP1为EAVLGLWGKVNVDEVGGEALGR、长度为22 aa,分子量为2 267.2 Da,其蛋白来源为血红蛋白,PP2为VILGAHEEYHLGEGVQEIDVSK,长度为22 aa,分子量为2 421.2 Da,其蛋白来源为纤溶酶原;然后将抑制肽PP1、PP2与组织蛋白酶L模拟分子对接,分析可知抑制肽与组织蛋白酶L可以通过活性中心紧密结合,分子间作用力键长范围为1.961 04～5.018 80?,其中PP1作用位点为H3、H4、H6、H14、N15、GLY20、GLN21和GLY23,组织蛋白酶L的作用位点为H166、H234、H239、H244、H256、H313、LYS117、SER158...     

猪皮胶原ACE抑制肽的纯化与鉴定

采用超声协同稀碱对猪皮实施预处理后,酶解30 min制得的高血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性水解液为原料,采用Sephadex G-15、半制备高效液相色谱分离纯化其中胶原ACE抑制肽并对其序列进行鉴定。结果表明,Sephadex G-15分离胶原ACE抑制肽的最佳分离条件为:样品浓度100 mg/m L;上样量2 m L;流速2 m L/min;洗脱剂为蒸馏水;层析柱为1 m×10 mm的层析柱。在该分离条件下,混合肽被分成AP-I、AP-II两个组分,IC50值分别为19.50、1.01 mg/m L。对抑制活性较强的AP-II进一步采用半制备高效液相色谱进行分离,得到8个组分峰,其中峰2、峰5和峰6的IC50值最小,分别为0.73、0.44和0.4 mg/m L。结合IC50值的大小及半制备收集到样品的量,对峰2和峰6采用LC-MS/MS进行序列分析。结果显示峰2的多肽序列为QGPPGPAGPR(P为Hyp),峰6的序列为AGPPGPPGPA,这两个序列位于胶原蛋白α1链中526?535、730?739位。     

鲢鱼背肌组织蛋白酶L的初步分离及蛋白层析纯化方法

研究鲢鱼背肌中组织蛋白酶L的初步分离和纯化方法,重点研究初步分离过程中酸化处理条件、硫酸铵饱和度和透析袋分子质量对粗酶液中组织蛋白酶L活性的影响,以及纯化过程中不同类型离子交换层析柱和离子交换平衡缓冲液pH值对蛋白层析纯化的影响。结果表明:盐析最佳硫酸铵饱和度范围55%~90%,酸处理最优条件pH 3.0,40 ℃热处理10 min后pH值回调至6.0,透析袋最佳分子质量7 000 u。采用弱阴离子交换和分子筛两步层析法,选取20 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液作为弱阴离子柱的平衡缓冲液,可得到45 ku电泳纯组织蛋白酶L,其纯化倍数为487,回收率为22 mg/1 000 g。本法可最大限度地去除杂蛋白且操作简便、回收率高,为探究鱼糜凝胶劣化现象的有效抑制方法奠定了良好的基础。     

鲢鱼蛋白酶法水解产物的功能性质

采用复合蛋白酶对酸法提取的鲢鱼蛋白进行水解改性。以水解鲢鱼蛋白为原料,与未酶解的鲢鱼蛋白作对照,考察其溶解性、起泡性、乳化性、持水性油性及流变学特性。结果表明：经酶解后的鲢鱼蛋白在pH2～10的范围内溶解度均在90%以上,较未酶解蛋白有明显的改善;起泡性增加不明显,仅为1.85%,泡沫稳定性延长了60min;乳化性是未酶解蛋白的8倍,乳化稳定性增加;持水、持油性降低,黏度减小。该酶法水解对鲢鱼蛋白质的部分功能性质有一定的改善效果。     

大豆皮天冬氨酸蛋白酶的提取、纯化与鉴定

从大豆加工副产物——大豆皮的高值化利用出发,以大豆皮为原料,在纤维素酶辅助提取大豆皮蛋白质的基础上,利用CM-Sepharose柱离子交换层析纯化大豆皮蛋白粗提物,用SDS-PAGE分辨大豆皮蛋白粗提物和纯化后的蛋白质,对电泳凝胶分辨出来的蛋白条带用基质辅助激光解析电离飞行时间二级质谱(MALDI-TOF-TOF MS)进行鉴定,并测定了其在pH 2~6范围内的酶活性,结果表明首次从大豆皮中纯化鉴定出类猪笼草蛋白酶I大豆天冬氨酸蛋白酶,得率为233 mg/kg,纯化后的类猪笼草蛋白酶I大豆天冬氨酸蛋白酶在pH 3时对血红蛋白的比活力最高,为62.1 U/mg。     

白鲢鱼肌肉脂肪氧合酶的分离纯化与鉴定

采用硫酸氨沉淀和羟基磷灰石柱层析法分离白鲢鱼肌肉脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX),同时采用反相高效液相(RP-HPLC)检测其反应产物,对鲢鱼肌肉LOX 进行鉴定,并研究鲢鱼肌肉LOX 的底物特异性。结果表明：白鲢鱼肌肉LOX 催化花生四烯酸主要形成12- 氢过氧化物,12-LOX 是鲢鱼肌肉中主要的LOX;白鲢鱼LOX的最适底物是亚麻酸。     

白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶的纯化及酶学特性

通过粗分离、50%～80%饱和度硫酸铵分级沉降、DE-52阴离子交换柱层析等步骤,从白鲢鱼背侧肌中分离纯化出焦磷酸酶。通过变性凝胶电泳分析,该酶在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中仅有一个分子质量为40 kD的条带。酶学特性研究表明,白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶可专一性地水解焦磷酸盐,反应初速率时间范围为0～15 min,最适反应温度为45 ℃,最适反应pH值为7.5。Mg2＋对该酶有明显的激活作用,在Mg2＋浓度为5 mmol/L时酶活力最高。5 mmol/L的Ca2＋、Zn2＋、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均对该酶有强烈的抑制作用。该酶水解焦磷酸四钠的最大反应速率为0.051 U/mg,米氏常数为0.54 mmol/L。     

草鱼肝胰中CPIs初步分离鉴定及其活性测定

首先比较了偶氮酪蛋白(Azocasein)法和荧光合成肽底物法,在监测草鱼肝胰半胱氨酸蛋白酶抑制剂CPIs(cysteine proteinase inhibitors)活性时的适用性。进而通过凝胶过滤高效液相色谱法、反相酶谱和免疫印迹法,对草鱼肝胰中CPIs的分子量分布及可能的家族类型进行定性鉴定。结果表明在粗提液中加入丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂(40 mmol/L PMSF或0.4 mmol/L Pefabloc SC),或经90℃加热5 min,仅荧光合成肽底物法可准确地监测到CPIs活性的变化。液相色谱结果显示,草鱼肝胰中存在分子量(98、26、12、5~1 ku)不同的CPIs活性部分。但反相酶谱法仅能够判断其中大于20 ku的CPIs。而免疫印迹法证明存在约12 ku的Cystatin(家族II)类型CPIs,发现小于12 ku的显色条带,可能是该蛋白降解形成的低分子量的活性片段。      

两种酶水解鲢鱼蛋白产物功能性质研究

采用Alcalase 2.4L和Flavourzyme 500L蛋白酶对鲢鱼肉进行水解,研究了水解产物的水解度与体系的pH值对其功能性质的影响。水解产物的溶解度在pH4时最低,碱性时具有较高的溶解度;浊度随pH值变化趋势与溶解度相反,浊度越大,溶解度越小。随水解度的增加,水解产物的乳化活性指数、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性减小(p<0.05);在水解度相同情况下,水解产物的功能性质取决于所用酶的种类。结果表明,鲢鱼肉蛋白水解产物的功能性质受其水解度和所用酶种类的影响。     

广西本地鲢鱼和长丰鲢肌肉营养成分分析与品质评价

为比较分析广西本地鲢和长丰鲢肌肉品质差异,选取这两个鲢鱼群体中体质量相近的雌雄个体各5尾,测定这4组鱼肉的营养成分、系水力、酸度以及质构特性等相关指标,并进行肌肉营养评价。结果显示:4组鱼肉中粗蛋白含量丰富(17.34%~18.57%),本地鲢雌雄鱼肌肉粗脂肪、粗灰分显著高于长丰鲢,但硬度、弹性和咀嚼性均显著低于长丰鲢雄鱼(P<0.05)。本地鲢雄鱼的回复性显著高于其余3组鱼肉,但粘性显著低于长丰鲢雌鱼(P<0.05),两种鲢鱼雌雄个体间的大部分质构指标差异不明显。4组鱼肉检测出的17种氨基酸中,Asp含量最高,其次为Glu和Lys,His和Cys的含量最低,EAA/TAA和EAA/NEAA的比值分别在39.61%~41.11%和65.60%~69.80%之间,与WHO/FAO要求的40%和60%的理想蛋白质比值接近;氨基酸指数(EAAI)均高于85分(86.13~100.00)。本地鲢雄鱼的∑TAA、∑EAA、∑FAA及EAAI均为最高。4组鱼肉检测出的脂肪酸种类均多于20种,且∑UFA和∑PUFA分别占脂肪酸总量在80%和40%以上。除长丰鲢雄鱼外,其余3组鱼肉的DHA含量均为最高,分别为30.40%、40.36%和24.01%。本地鲢的∑PUFA以及EPA+DHA含量均高于长丰鲢,而∑SFA略低于长丰鲢。结论:两种鲢鱼肌肉营养含量和组成比例均能较好地满足人体需求,本地鲢肌肉较长丰鲢更嫩,多不饱和脂肪酸含量更高。