SHP-2酪氨酸磷酸酶C—SH2结构域的表达纯化和NMR研究

SHP-2是一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶.将其N末端结构域C-SH2克隆至原核表达载体pGEX-2T中,命名为pGEX-2T-C-SH2.该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于菌体上清液中,经GST亲和层析柱和FPLC分子筛柱纯化后,目的蛋白纯度可达98%.质谱分析表明,目的蛋白相对分子量与理论值基本相同.在最适表达条件下,1 L的M9培养基能够高效表达并获得12 mg C-SH2蛋白,NMR结构和活性位点的分析表明,目的蛋白能正确折叠并呈规则的空间结构.     

三种FLAG融合标签的构建、表达及亲和常数测定

FLAG融合标签是由8个氨基酸组成的短肽,可用于重组蛋白的免疫吸附纯化。为了建立一个基于FLAG融合标签的共表达纯化体系,将2个新的FLAG标签序列DYKDYKDYK和DYKDEDDK与FLAG标签的原有序列DYKDDDDK分别命名为FLAG1、FLAG2和FLAG3,利用PCR将FLAG标签融合到SHP2酪氨酸磷酸酶NSH2结构域序列的C端,并将其重组到原核表达载体pGEX-2T中,并在大肠杆菌中进行表达。利用GST亲和层析柱和分子筛层析柱纯化融合蛋白,Western blotting法检测其免疫活性。免疫印迹结果表明,3个FLAG融合标签都可以被抗-FLAG单克隆抗体M2(AFM2)特异性识别。利用ELISA技术测定3个FLAG标签与AFM2的亲和常数(1/Kd),其Kd值分别为0.143 80、.128 1、0.080 1μmol/L。     

转录因子AP-2α与TES蛋白相互作用分析

为研究转录因子AP-2α与TES蛋白的相互作用机制,分别构建AP-2α与GST的融合蛋白原核表达载体及TES与His的融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌E.coli BL 21中诱导表达,表达产物经纯化后用GST Pull-down及免疫印迹技术分析其相互作用关系.实验结果表明,AP-2α与TES之间存在相互作用是由于AP-2αC端能与TES C端的首个LIM结构域结合,酵母双杂交实验也证实了该结果;同时根据AP-2α只能与TES C端而不能与TES全长蛋白结合的实验事实提出了TES蛋白存在自身相互作用的可能,这种自身折叠封闭了位于TES C端首个LIM结构域上的AP-2α结合位点.     

人源血管紧张素转化酶-N结构域基因片段在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法从食管癌细胞TE-1中反转出cDNA,PCR扩增得到血管紧张素转化酶N结构域(ACE-N)基因片段,构建pPIC9K-ACE-N表达载体,转化毕赤酵母GSll5,阳性克隆再次电转,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子进行表达.经Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11 g/L,其纯度大于99％.为今后选择性抑制血管紧张素转化酶两个同源结构域的体外研究奠定基础.     

三叶半夏凝集素C端结构域的可溶表达及其活性研究

利用pET-32-SUMO表达载体在大肠杆菌中可溶表达三叶半夏凝集素C端结构域(P-D2),并研究其凝血活性、糖结合特异性以及肿瘤抑制活性。实验结果表明,P-D2蛋白的产量为5mg/L。该蛋白具有凝集小鼠红细胞的活性,可以被D-甘露聚糖抑制,但不能被D-乳糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖抑制。P-D2蛋白的体外抗肿瘤活性实验表明其对肝癌细胞Bel-7404以及结肠癌细胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡现象观察实验发现P-D2蛋白可以诱导癌细胞Bel-7404的凋亡。这是首次在大肠杆菌表达系统中表达了可溶的半夏凝集素C端结构域,为其他凝集素的可溶表达提供了新的选择。     

三叶半夏凝集素C端结构域的可溶表达及其活性研究

利用pET-32-SUMO表达载体在大肠杆菌中可溶表达三叶半夏凝集素C端结构域（P-D2）,并研究其凝血活性、糖结合特异性以及肿瘤抑制活性。实验结果表明,P-D2蛋白的产量为5mg/L。该蛋白具有凝集小鼠红细胞的活性,可以被D-甘露聚糖抑制,但不能被D-乳糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖抑制。P-D2蛋白的体外抗肿瘤活性实验表明其对肝癌细胞Bel-7404以及结肠癌细胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡现象观察实验发现P-D2蛋白可以诱导癌细胞Bel-7404的凋亡。这是首次在大肠杆菌表达系统中表达了可溶的半夏凝集素C端结构域,为其他凝集素的可溶表达提供了新的选择。     

利用酵母表达体系研究大豆SALI3-2蛋白功能

以含有大豆Sali3-2cDNA的重组载体为模版,扩增出SALI3-2蛋白及其缺失信号肽的SIcDNA片段,构建酵母表达载体pYES2/S、pYES2/SI以及可表达SALI3-2-His6的pYES2/SH.空载体pYES2/ct和重组载体在转化酿酒酵母INVSC1后得到相应的酵母重组子INV/CK(对照菌)、INV/S、INV/SI和INV/SH.Westernblot实验结果表明,SALI3-2蛋白在酵母INVSC1中可被半乳糖诱导表达.对INV/CK、转基因的重组菌INV/S、INV/SI在无胁迫、含1.5mol/LNaCl或山梨醇培养基中的生长情况进行分析.结果表明,大豆SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达对无胁迫条件下酵母的生长没有影响,而在NaCl胁迫下可明显提高酵母转化子的耐盐能力.信号肽的缺失使SALI3-2蛋白的耐盐能力有所下降,可见信号肽对该蛋白耐盐功能的发挥有重要作用.另外,SALI3-2蛋白及其缺失多肽SI的表达不能提高酵母重组子的抗渗透能力,表明SALI3-2蛋白对细胞不具有明显的渗透胁迫调节作用.     

龙葵韧皮部特异Ⅱ型蛋白酶抑制剂的分离纯化和部分特性分析

龙葵蛋白酶抑制剂Ⅱa(Solanum americanum proteinase inhibitor Ⅱa,SaPIN2a)基因是第一个被发现在植物韧皮部中特异表达的蛋白酶抑制剂Ⅱ(PIN2)基因.以野生型龙葵的茎为材料,经过粉碎→浸提→超滤→(NH4)SO4沉淀→分子排阻层析→离子交换层析→胰蛋白酶亲和层析一系列的处理后,分离纯化得到一个丝氨酸蛋白酶抑制剂,SDS-PAGE结果显示其表观分子量约为20 kDa.对该纯化的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了蛋白质测序工作.结果得到该蛋白N端23个氨基酸残基的序列为:KACTRECGHFSYGICPRSEGSPQ,经过Blast比对分析发现这23个氨基酸残基为成熟型SaPIN2a(即不含信号肽的SaPIN2a)N端序列.     

PSTI1可提高大肠杆菌应答胁迫能力

指出含典型34肽重复序列结构域(tetratricopeptide repeat,TPR)的胁迫诱导蛋白(stress-in-ducible protein-1,STI1)是真核生物特有的一类与胁迫应答有关的分子伴侣蛋白.作者从多头绒泡菌分离出一个STI1类似蛋白cDNA,因其编码蛋白含有两个非典型的TPR结构域,命名为PSTI1.为了解PSTI1对原核生物胁迫应答功能的影响,观察表达PSTI1的大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)与原菌株的增殖差异,发现PSTI1表达菌耐受盐、渗透压、重金属离子、氧化、缺氧和酸碱变化胁迫的能力均增强,但对高温敏感.PSTI1保守结构域TPR1能提高E.coli耐受渗透压胁迫的能力,但TPR2会使E.coli对盐和渗透压胁迫敏感,说明TPR1和TPR2在PSTI1调控胁迫应答中可能扮演不同角色.通过pull-down和质谱分析技术检测了与PSTI1作用的E.coli蛋白,发现PSTI1能与E.coli的HtpG(Hsp90)、La蛋白酶和过氧化氢酶HpII等作用,说明PSTI1具有原核生物非典型TPR结构域蛋白的类似功能,是类似STI1的胁迫应答蛋白.     

亚甲基和亚乙基二(二甲基二硫代氨基甲酸酯)的合成及结构表征

通过 X-射线晶体衍射 ,确定了 ( Me2 NCS2 ) 2 CH2 (化合物 I)和Me2 NCS2 CH2 CH2 S2 CNMe2 (化合物 )的晶体和分子结构。 ( M2 NCS2 ) 2 CH2 属于正交晶系 ,空间群为 :Pca2 1 ,晶胞参数为 :a=1 3.80 99( 3) ,b=4.345 3( 1 ) ,c=2 0 .3686( 4 ) ,Z=4。 Me2 NCS2 CH2 CH2 S2 CNMe2 属单斜晶系 ,空间群为 :P2 1/c,晶胞参数为 :a=6.0 69( 7) ,b=7.82 9( 2 ) ,c=1 3.45 5 ( 3) ,β =91 .76( 3)°,Z=2。它们都包含了由硫原子与烷基相连的两个二甲基二硫代氨基甲酸酯基团。在化合物 I中 ,由亚甲基相连的两个二甲基二硫代氨基甲酸酯平面间的二面角是 5 5 .92 ( 2 )°。在化合物 II中 ,原子 S1、C4、C41、S1 1所在平面与二甲基二硫代氨基甲酸酯的原子所在平面间的二面角为 84.4( 2 )°。在两种结构中 ,S2…C4的距离 (分别为 3.0 899( 2 ) ,3.0 966( 3) )比范德华半径 ( 3.5 5 )小很多。范德华力对晶体结构起到稳定作用     

K2Ca2Cu(SO4)4·2H2O复盐的合成与表征

以3种简单盐类为原料,在50℃下用水热合成法制备了结晶优良的硫酸钙复盐K2Ca2Cu(SO4)4.2H2O,并通过X射线衍射、红外光谱与拉曼光谱分析、扫描电子显微分析等现代测试手段对其性能进行了表征,验证了该复盐带有2个分子的结晶水,测得了复盐的红外光谱与拉曼光谱的特征波数,清晰地观测了复盐的晶体形貌。     

Al2O3-SiO2-ZrO2-TiO2复合溶胶的制备工艺

以Al(NO3)3.9H2O、Si(OC2H5)4、ZrOCl2.8H2O和Ti(OC4H9)4为原料,用sol-gel法通过分步水解得到透明稳定性能好的复合溶胶,并采用XRD和SEM等测试技术对复合溶胶的相组成及其微观形貌进行了表征。实验发现:ZrOCl2.8H2O的预水解溶液的pH<1,用它作为胶溶剂可合成性能好的复合溶胶;若不加硅烷偶联剂,当Al、Si物质的量比n(Al)∶n(Si)<2∶1时,得不到性能稳定的复合溶胶;改变Ti组分的加入量,复合薄膜的主晶相将发生改变。     

Na_2O-SiO_2-ZrO_2-TiO_2系统玻璃耐碱机理的研究

本文采用了分光光度法、原子吸收光谱法及电子探针(EPMA)等手段,对Na_2O-SiO_2-ZrO_2-TiO_2系统玻璃进行了耐碱机理的初步探讨。用相关分析对碱蚀液中ZrO_2、TiO_2、SiO_2等氧化物的碱溶出行为及各氧化物在玻纤表面上的残留行为进行了讨论。     

Thermodynamic study of K_2CrO_4-KAlO_2-KOH-H_2O and Na_2CrO_4-NaAlO_2-NaOH-H_2O systems

Phase diagrams of complex multi-component aqueous chromium salt system are the important theoretical bases for increasing the recovery ratio of chromium and reducing the poisonous waste in the chromate production process. Phase equilibrium of multi-component system has been calculated from the limited known data with thermodynamic models. The phase equilibriums of KOH-K2CrO4-H2O, KOH-KAlO2-H2O, NaOH-Na2CrO4-H2O and NaOH-NaAlO2-H2O systems were calculated with thermodynamic models. The solubilities of Cr and Al was measured in the systems at different temperatures. The results were compared with experimental data and they are consistent with each other. It shows that the lower concentration of KOH (or NaOH) is favorable for the crystallization of KAlO2 (or NaAlO2) and higher concentration of KOH (or NaOH) is favorable for the crystallization of K2CrO4 (Na2CrO4). Therefore, K2CrO4 (or Na2CrO4) can be separated from KAlO2 (or NaAlO2) with controlling the KOH concentration in solutions of KOH-K2CrO4-KAlO2-H2     

Bi2Sr2Co2Oy热电材料的制备

为了研究Bi2Sr2Co2Oy热电陶瓷的不同制备方法,实验采用固相反应法和溶胶-凝胶法制备Bi2Sr2Co2Oy陶瓷．用XRD,SEM等表征技术研究了样品的物相及显微组织形貌．结果表明：样品为单相,组织均匀,为层片状结构,且具有明显的c轴择优取向．     

BaF2-CaF2-CaCl2三元系熔盐电解体系的物理化学性质

研究了BaF2-CaF2-CaCl2三元系电解质体系的物理化学性质,为熔盐电解法制备Al-Ca合金奠定基础.采用阿基米德法,测定了BaF2-CaF2-CaCl2体系的密度;采用差热-热重分析法,测定了BaF2-CaF2-CaCl2体系初晶温度;采用连续变化电导池常数（CVCC）法,测定了BaF2-CaF2-CaCl2体系的电导率;采用循环伏安法研究了该体系的电化学行为.     

复合氧化物S_2O_8~(2-)/ZrO_2-SnO_2-SiO_2的制备与研究

固体超强酸作为多相酸催化材料,具有许多传统质子酸催化剂无法比拟的优点,本论文在研究SO_4~(2-)/M_xO_y型固超酸的基础上,采用过硫酸铵溶液作为浸渍剂,选取ZrO_2、SnO_2、SiO_2的复合氧化物,将过硫酸根离子负载在上面,制备出新型S_2O_8~(2-)/ZrO_2-SnO_2-SiO_2固体超强酸催化剂.     

FusionCharts在Struts2中的应用

通过一个实例展示了在Struts2框架下获取图表数据,动态生成XMI。文件,并使用Fu—sionCharts组件技术显示Flash图表的方法．结果表明,FusionCharts组件在Struts2框架下使用简单,显示的图表形式多样、实用美观．     

Li2O-Al2O3-SiO2系统光敏微晶玻璃的制备

光敏微晶玻璃在电子、生物医药等领域应用前景非常广泛.本论文利用XRD和SEM技术,研究了热处理和光辐照条件对Li2O-Al2O3-SiO2系统微晶玻璃光敏性能的影响,在合理确定工艺制度的基础上,制备出了孔穴排列良好的光敏微晶玻璃.