spoIIE基因缺失对克劳氏芽孢杆菌淀粉酶酶活的影响

通过对克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii) QL-1spoIIE基因敲除,研究了其对菌体芽孢形成、生物量以及淀粉酶酶活的影响。将重叠的spoIIE-Cmr片段电转化至B.clausii QL-1感受态细胞,仅通过一次同源单交换实现对spoIIE基因快速敲除,成功获得spoIIE基因缺失菌株B.clausii QL-1ΔspoIIE。发酵培养B.clausii QL-1ΔspoIIE与出发菌株相比,B.clausii QL-1ΔspoIIE芽孢生成率28 h降低为0.48%,20 h生物量提高了20%,84 h淀粉酶酶活是出发菌株的5.58倍,通过补料发酵B.clausii QL-1ΔspoIIE菌株80 h最大生物量达到7.2 mg·m L~(-1),84 h淀粉酶酶活达到690 U·m L~(-1),较未补料前提高了33.30%。经验证spoIIE基因为B.clausii QL-1芽孢形成关键基因,同时它的缺失有利于淀粉酶酶活的提高,这对后续构建芽孢杆菌类高产淀粉酶工业生产菌株具有重要意义。     

无痕敲除法构建食品安全级枯草芽孢杆菌无芽孢菌株

利用同源重组法快速构建枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis168)spo0A基因缺陷型无芽孢菌株B.subtilis168Δspo0A。经PCR及核酸电泳验证,孢子形成率鉴定和芽孢染色镜检,确定最终获得不产芽孢的B.subtilis168Δspo0A基因缺失突变菌株。基因敲除完成后,菌株基因组不需引入抗性基因或其它任何筛选标记,实现了对spo0A基因的无痕基因敲除。本研究对枯草杆菌的工业化生产及提高相关产品食品质量安全性具有重要意义。      

一株芽孢表面稳定展示海藻糖合酶工程菌的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168-Tres基因组为模板,PCR扩增得到同源臂基因sleB1和cwlJ1,重叠PCR连接sleB1与卡那霉素抗性(kmr )基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleB菌株;连接cwlJ1与博来霉素抗性(zeor)基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ菌株。结果表明,经kmr、zeor抗性筛选及PCR鉴定,成功获得sleB、cwlJ基因双缺失菌株B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ;发酵结果显示,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ与出发菌株的芽孢形成率一致,约为88%;在LB固体培养基和麦芽糖转化生成海藻糖体系中B. subtilis 168-Tres的芽孢萌发数为4.8×108 CFU/mL,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ芽孢未萌发;在麦芽糖转化生成海藻糖体系中,重组菌海藻糖合酶酶活为10.42 U,比原始菌提高了78.7%。敲除sleB、cwlJ基因后,不影响枯草芽孢杆菌生成芽孢的量,但能有效控制芽孢在上述转化体系中的萌发,使芽孢表面稳定展示海藻糖合酶,提高了芽孢的利用率。     

一种中性普鲁兰酶的高效表达及重组酶在粉丝制作中的应用

为获得适合粉丝制作工艺的普鲁兰酶,研究了嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)普鲁兰酶基因Gs P在不同枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主菌中的表达及重组酶的应用效果。分别以淀粉酶基因缺失的枯草芽孢杆菌1A717和蛋白酶基因缺失的菌株WB600为宿主菌,构建了表达Gs P的重组菌,酶活检测和SDS-PAGE分析表明,两种重组菌产生的普鲁兰酶均为胞外酶,分别命名为Gs P1a和Gs Pwb。两种重组酶分别用于粉丝制作,以Gs P1a处理的芡糊制作的粉丝成品断条率接近于0,由Gs Pwb处理的芡糊制作的粉丝断条率高于前者,这可能与宿主菌WB600在发酵过程中产生的α-淀粉酶有关。该研究表明,中性普鲁兰酶是粉丝制作中明矾的理想替代物,酶液中α-淀粉酶活性的去除有利于其应用性能的提升。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

透明颤菌vgb基因在地衣芽孢杆菌中表达用于改良α-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶是淀粉加工与食品发酵工业上关键酶制剂之一。为了降低高温α-淀粉酶生产过程中所需要的高溶氧水平对设备的要求,进一步提高α-淀粉酶的生产性能,本研究构建同源整合载体pAX01-sacB-vgb,在地衣芽孢杆菌(B.licheniforms)CICC 10181染色体中表达增强摄氧的透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb)。发酵实验结果表明,在同等溶氧条件下,重组菌比野生菌生物量提高了45.8%,高温α-淀粉酶酶活提高了116.7%,具有良好的工业应用前景。     

产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定

从土壤中分离筛选出产淀粉酶的菌株,经淀粉培养基初筛后,采用DNS法对发酵提取的粗酶液进行总酶活和α-淀粉酶活力的测定,通过形态观察和生理生化反应对筛出的菌株进行鉴定。结果表明:分离到4株产淀粉酶芽孢杆菌,测得其透明圈直径与菌落直径比值在1.7~3.5之间,其中有2株菌株产淀粉酶能力较高,总酶活达到19.760 U/mL和15.432 U/mL;4株芽孢杆菌所产α-淀粉酶酶活在6.4 U/mL~10.4 U/mL之间。经鉴定,1株为枯草芽孢杆菌,3株为蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能力优于蜡样芽孢杆菌。     

Bacillus subtilis ZJF-1A5产中温α-淀粉酶发酵工艺优化

枯草芽孢杆菌是生产中温α-淀粉酶的重要菌株,以B.subtilis ZJF-1A5为生产菌株,对其发酵生产中温α-淀粉酶最佳工艺参数进行优化。采用摇床培养方法对接种量、培养温度、溶氧、溶液pH及发酵结束时间等因素进行优化,并在最优工艺参数下对枯草芽孢杆菌生长及产酶特性进行研究。结果表明,以DE值为18的糊精作为碳源时,Bacillus subtilis ZJF-1A5时最佳工艺参数为:接种量4%,培养温度37℃,初始pH5.0,摇床转速210r/min,培养时间54h。在此工艺条件下对B.subtilis ZJF-1A5生长与产酶特性进行研究,9~15h为对数生长期,15~48h为稳定生长期,48h以后为衰退期;发酵54h后,酶活达到最大值。此研究为B.subtilis ZJF-1A5发酵生产中温α-淀粉酶工业化生产提供重要理论及实践意义。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

Bacillus subtilis ZJF-1A5产中温α-淀粉酶发酵工艺优化

枯草芽孢杆菌是生产中温α-淀粉酶的重要菌株,以B.subtilis ZJF-1A5为生产菌株,对其发酵生产中温α-淀粉酶最佳工艺参数进行优化。采用摇床培养方法对接种量、培养温度、溶氧、溶液pH及发酵结束时间等因素进行优化,并在最优工艺参数下对枯草芽孢杆菌生长及产酶特性进行研究。结果表明,以DE值为18的糊精作为碳源时,Bacillus subtilis ZJF-1A5时最佳工艺参数为:接种量4%,培养温度37℃,初始pH5.0,摇床转速210r/min,培养时间54h。在此工艺条件下对B.subtilis ZJF-1A5生长与产酶特性进行研究,9¹5h为对数生长期,15⁴8h为稳定生长期,48h以后为衰退期;发酵54h后,酶活达到最大值。此研究为B.subtilis ZJF-1A5发酵生产中温α-淀粉酶工业化生产提供重要理论及实践意义。      

提高乙酸耐受性酿酒酵母JJJ1突变株构建及转录组学分析

目的 构建JJJ1突变株以提高酿酒酵母在发酵过程中的乙酸耐受性,提高发酵效率。方法 本研究采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建酿酒酵母JJJ1Δ突变株,检测突变对酿酒酵母菌株的乙酸耐受性影响,基于转录组学分析突变株耐受乙酸的分子机制。结果 在含有5 g/L乙酸的液体培养基中,酿酒酵母JJJ1Δ存活率是野生型菌株的4.44倍,发酵72 h后酿酒酵母突变株JJJ1Δ的细胞生物量是野生型菌株的1.15倍,酿酒酵母JJJ1Δ的生长延滞期比野生型菌株缩短了30 h;转录组学研究表明,敲除JJJ1基因增强酿酒酵母的代谢、生物调控、膜流动性以及转运活性和电子转移活性,减少酿酒酵母细胞生理过程、细胞连接和拟核功能以及细胞结合功能。结论 敲除JJJ1基因的酿酒酵母突变株通过提高能量代谢和氨基酸合成,降低核糖体生物发生减少细胞生理活动,增强酿酒酵母菌株乙酸耐受性。     

1dhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822 发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（Corynebactenum glutamicum） TCCC 11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△1dh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因1dhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的.结果表明,与出发菌株相比1dhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6％,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6％和5.5％,但生物量略有下降.本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考.     

通过敲除聚谷氨酸合成基因提高纳豆杆菌纳豆激酶的生产效率

纳豆激酶是纳豆杆菌(Bacillus natto)产生的具有溶栓作用的酶,纳豆杆菌液体发酵时产生的聚谷氨酸(polygutamic acid,γ-PGA)使发酵液黏度升高,导致纳豆激酶分离纯化困难,成本较高,限制了其规模化生产.该研究采用同源重组双交换技术,敲除纳豆杆菌中合成 γ-PGA的关键基因pgsB,降低发酵液中...     

Anaerobic and aerobic batch cultivations of Saccharomyces cerevisiae mutants impaired in glycerol synthesis

Glycerol is formed as a by-product in production of ethanol and baker's yeast during fermentation of Saccharomyces cerevisiae under anaerobic and aerobic growth conditions, respectively. One physiological role of glycerol formation by yeast is to reoxidize NADH, formed in synthesis of biomass and secondary fermentation products, to NAD(+). The objective of this study was to evaluate whether introduction of a new pathway for reoxidation of NADH, in a yeast strain where glycerol synthesis had been impaired, would result in elimination of glycerol production and lead to increased yields of ethanol and biomass under anaerobic and aerobic growth conditions, respectively. This was done by deletion of GPD1 and GPD2, encoding two isoenzymes of glycerol 3-phosphate dehydrogenase, and expression of a cytoplasmic transhydrogenase from Azotobacter vinelandii, encoded by cth. In anaerobic batch fermentations of strain TN5 (gpd2-Delta1), formation of glycerol was significantly impaired, which resulted in reduction of the maximum specific growth rate from 0.41/h in the wild-type to 0.08/h. Deletion of GPD2 also resulted in a reduced biomass yield, but did not affect formation of the remaining products. The modest effect of the GPD1 deletion under anaerobic conditions on the maximum specific growth rate and product yields clearly showed that Gdh2p is the important factor in glycerol formation during anaerobic growth. Strain TN6 (gpd1-Delta1 gpd2-Delta1) was unable to grow under anaerobic conditions due to the inability of the strain to reoxidize NADH to NAD(+) by synthesis of glycerol. Also, strain TN23 (gpd1-Delta1 gpd2-Delta1 YEp24-PGKp-cth-PGKt) was unable to grow anaerobically, leading to the conclusion that the NAD(+) pool became limiting in biomass synthesis before the nucleotide levels favoured a transhydrogenase reaction that could convert NADH and NADP(+) to NADPH and NAD(+). Deletion of either GPD1 or GPD2 in the wild-type resulted in a dramatic reduction of the glycerol yields in the aerobic batch cultivations of strains TN4 (gpd1-Delta1) and TN5 (gpd2-Delta1) without serious effects on the maximum specific growth rates or the biomass yields. Deletion of both GPD1 and GPD2 in strain TN6 (gpd1-Delta1 gpd2-Delta1) resulted in a dramatic reduction in the maximum specific growth rate and in biomass formation. Expression of the cytoplasmic transhydrogenase in the double mutant, resulting in TN23, gave a further decrease in micromax from 0.17/h in strain TN6 to 0.09/h in strain TN23, since the transhydrogenase reaction was in the direction from NADPH and NADP(+) to NADH and NADP(+). Thus, it was not possible to introduce an alternative pathway for reoxidation of NADH in the cytoplasm by expression of the transhydrogenase from A. vinelandii in a S. cerevisiae strain with a double deletion in GPD1 and GPD2.     

黑曲霉TNA-09中α-葡萄糖苷酶基因敲除的研究

以柠檬酸生产菌黑曲霉TNA—09为原始菌株,通过农杆菌介导的方法,将其α-葡萄糖苷酶基因敲除,得到基因敲除菌株TGA101。对原始菌株黑曲霉TNA-09和基因敲除菌TGA101 α-葡萄糖苷酶活力测定,结果相对于TNA—09菌株,TGA101菌株α-葡萄糖苷酶活力下降61．15％。在柠檬酸发酵试验中表现出相对于黑曲霉TNA-09,TGA101菌株发酵液中异麦芽糖含量降低84．67％,柠檬酸提高2．34％,糖酸转化率提高2．34％。     

酿酒酵母蔗糖关键代谢途径基因的敲除及其生长特性的变化分析

该研究以酿酒酵母（Sacchromyces cerevisiae）IMX581为出发菌株，利用Crispr-Cas9基因编辑的方法敲除其蔗糖消耗途径中的蔗糖转化酶基因Suc2和麦芽糖酶基因MAL32、MAL12、MAL22，构建工程菌株IMX581△Suc2和IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22，并对其生长特性及蔗糖消耗情况进行分析。结果表明，当初始OD600 nm值为0.1时，菌株IMX581△Suc2在以蔗糖为唯一碳源的培养基上仍然可以生长，但培养56 h时，生物量是出发菌株IMX581的52%，而菌株IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22几乎不生长。当初始OD600 nm值为0.1、5.0及10.0时，菌株IMX581△Suc2和IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22培养72 h后，蔗糖的消耗率较出发菌株IMX581均显著下降，分别为28.5%、35.5%、38.5%和7.0%、18.4%、22.5%。因此，成功构建了显著降低蔗糖消耗的菌株IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22，为研究酿酒酵母对蔗糖的利用及调控提供了参考。     

透明颤菌血红蛋白基因表达对腐霉合成二十碳五烯酸的作用

通过研究腐霉菌体内透明颤菌血红蛋白基因的表达及工程菌株的生长代谢特性,解决其发酵过程中溶解氧限制的问题,从而提高二十碳五烯酸的产量。构建了血红蛋白基因表达载体,通过农杆菌LBA4404介导的方法导入丝状真菌腐霉,成功构建血红蛋白基因腐霉工程菌,摇瓶发酵研究血红蛋白基因表达对腐霉工程菌生长代谢特性的影响。研究结果表明血红蛋白基因正常表达,在优化的培养条件下,摇瓶结果显示,腐霉V1的生物量、油脂量及油脂中二十碳五烯酸含量较出发菌株分别提高了4.80%,4.82%和11.69%,EPA产量为1 004.96 mg/L。     

TOR1基因缺失对酿酒酵母耐受性的影响

酿酒酵母是最常见且应用最为广泛的酵母菌种,是以糖质和淀粉质为原料的乙醇发酵最经典的菌株.在发酵过程中,有很多不可避免的胁迫环境如高温条件、高渗条件等出现,这些胁迫会阻碍细胞生长并降低细胞的发酵能力,给发酵行业带来一定的经济损失.因此,为改善菌种的耐受性,该研究主要以实验室现有菌株AY12a为亲本菌株,URA3基因作筛选...