冷应激对大鼠肝脏组织中Rap1b表达的影响

目的探讨冷应激对大鼠肝脏组织中Rap1b表达的影响。方法将20只Wistar大鼠随机分为常温饲养组和冷应激组,每组10只,正常饲养温度为(24.0±0.1)℃,冷应激温度为(4.0±0.1)℃。经12 h冷刺激后,采集大鼠肝脏组织,提取总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测Rap1b基因m RNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果冷应激组大鼠肝脏组织中Rap1b基因m RNA的转录水平和蛋白表达水平均显著高于常温饲养组(P0.01)。结论冷应激可显著提高大鼠肝脏组织中Rap1b基因m RNA的转录水平和蛋白表达水平。     

基于高通量测序的冷应激大鼠肝脏mRNA差异表达分析

目的高通量测序技术分析冷应激大鼠肝脏基因mRNA差异表达。方法将SPF级大鼠随机分为冷刺激组[(4±0. 05)℃]及常温对照组[(24±0. 05)℃],刺激24 h。采集2组大鼠肝脏组织并提取总RNA,应用Ⅲumina HiSeg平台测序,对筛选的差异表达基因进行基因功能(Gene Ontology,GO)注释及信号通路数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,采用qRT-PCR验证随机筛选的基因mRNA表达水平。结果经测序分析,冷刺激组发掘新基因293个,其中244个有功能注释,差异表达基因98个;经GO分析,差异表达基因显著富集细胞过程、生物调控、代谢过程、细胞组分、细胞器、蛋白质运输等过程;经KEGG分析,大多数差异表达基因注释在原发性免疫缺陷、癌症形成过程、用于IgA生成的肠道免疫网络、细胞因子与细胞因子受体相互作用等通路,在MAPK、PI3K-Akt信号通路和内质网蛋白加工通路中表达量极高,在乙型肝炎和病毒感染通路表达量较低。与常温对照组比较,冷刺激组大鼠肝脏的多配体聚糖4(syndecan 4,Sdc4)及白蛋白(albumin,Alb)基因表达水平上调,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论成功筛选冷应激大鼠肝脏差异表达基因,该类基因很可能参与了机体代谢及损伤修复等过程,为深入研究大鼠冷应激机制积累了数据。     

冷应激大鼠体内miR-383-5p表达的变化及其功能的预测分析

目的探讨冷应激大鼠体内miR-383-5p表达的变化,并对其功能进行预测分析。方法将大鼠置(4±0. 05)℃冷暴露12 h,同时设对照组(24℃常温饲养),qRT-PCR法检测miR-383-5p在血清和肝脏中的表达水平。应用miRanda、TargetScan和miRDB 3种软件同时对miR-383-5p进行靶基因预测,并通过DAVID 6. 8软件对miR-383-5p肝脏靶基因进行GO和KEGG分析。qRT-PCR和Western blot法检测下调BRL-3A细胞中miR-383-5p表达对部分代谢相关靶基因mRNA转录及蛋白表达的影响。结果冷应激后小鼠血清及肝脏中的miR-383-5p相对表达量均显著下降(P 0. 05)。生物信息学方法预测出733个在大鼠肝脏表达的靶基因,GO富集分析结果显示这些靶基因主要与细胞氧化还原过程、增殖和凋亡相关,KEGG分析结果显示富集靶基因最多的信号通路是代谢通路。下调miR-383-5p表达使BRL-3A细胞中Mtor、Pfkfb1和Apbb3基因的mRNA的转录水平显著升高(P 0. 05),Pfkfb1蛋白的表达量显著升高(P 0. 05)。结论冷应激可降低大鼠肝脏中miR-383-5p的表达量,进而通过调节Pfkfb1等靶基因的表达参与细胞的代谢、增殖和凋亡。     

急性冷应激对大鼠糖皮质激素分泌及其受体在外周血淋巴细胞中表达的影响

目的探讨急性冷应激对大鼠糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)分泌及其受体(glucocorticoid receptor,GR)在外周血淋巴细胞中表达的影响。方法将雄性Wistar大鼠40只随机分为常温饲养组和急性冷应激6、12、24 h组,每组10只。试验大鼠经冷刺激后,收集大鼠血液,分离血清和外周血淋巴细胞,采用ELISA法检测各试验组大鼠血清中糖皮质激素皮质酮(corticosterone,CORT)浓度,q RT-PCR和Western blot法检测大鼠外周血淋巴细胞中GR基因m RNA和蛋白的表达水平。结果急性冷应激各组大鼠血清中CORT浓度均显著高于常温饲养组(P0.01);急性冷应激各组大鼠外周血淋巴细胞中GR基因m RNA和蛋白表达水平均显著低于常温饲养组(P0.05或0.01)。结论急性冷应激可促使试验大鼠血清CORT浓度持续升高,该过程伴随着大鼠外周血淋巴细胞中GR表达水平的持续降低。     

冷应激前后大鼠心脏、肝脏及脾脏中α-烯醇化酶基因mRNA的转录水平

目的研究冷应激前后大鼠心脏、肝脏、脾脏中α-烯醇化酶(α-enolase,ENO1)基因m RNA的转录水平。方法将大鼠随机分为正常对照组(24℃,正常饲喂7 d)和冷应激组(置4℃,应激12 h),提取各组大鼠心脏、肝脏及脾脏细胞总RNA,反转录成c DNA,以其为模板,PCR扩增ENO1基因,应用生物信息学软件DNAstar进行同源性分析,实时荧光定量PCR法检测大鼠心脏、肝脏、脾脏中ENO1基因m RNA的转录水平。结果冷应激前后大鼠心脏、肝脏及脾脏总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S和5S 3条带,A260/A280值为1.8~2.0;ENO1基因经2%琼脂糖凝胶电泳分析可见107 bp的目的基因条带;ENO1基因序列与NCBI上公布序列的同源性为100%;冷应激组大鼠肝脏、脾脏组织中ENO1基因m RNA的转录水平明显高于正常对照组(P0.01),正常对照组大鼠心脏组织中ENO1基因m RNA转录水平明显高于冷应激组(P0.05)。结论冷应激前后大鼠心脏、肝脏及脾脏中ENO1基因m RNA的转录水平均发生显著改变,本实验为动物应激状态评估及应激发生机制的研究提供了实验依据。     

冷应激前后大鼠肺脏、肾脏、肌肉及十二指肠α-烯醇化酶基因的定量

目的研究急性冷刺激对大鼠肺脏、肾脏、肌肉及十二指肠α-烯醇化酶(α-enolase,ENO1)基因表达量的影响。方法取健康大鼠10只,随机分为2组:冷应激组和正常对照组,每组5只。正常对照组饲养环境为24℃,冷应激组大鼠环境温度为4℃,应激时间为12 h。实验后分别取两组大鼠肺脏、肾脏、肌肉及十二指肠组织样品,应用实时荧光定量PCR检测应激前后大鼠四种内脏器官ENO1 m RNA表达量。结果冷应激组肺脏与十二指肠ENO1 m RNA表达水平显著高于正常对照组(P0.05);肾脏与肌肉ENO1 m RNA表达水平显著下降(P0.05)。结论急性冷刺激可通过影响肺脏、肌肉、肾脏及十二指肠ENO1基因表达调节代谢燃料的选择和应激反应程度。     

基于肝药代谢酶的附子配伍芍药减毒机制研究

目的:通过建立"Cocktail"探针药物法及体外肝微粒体孵育体系,测定大鼠肝微粒体中CYP1A2和CYP3A4酶的活性,并从蛋白和转录水平阐释附子芍药配伍对CYP450酶基因表达的影响。方法:采用"Cocktail"探针药物法,建立同时测定CYP1A2和CYP3A4酶两种探针底物的体外肝微粒体孵育体系;采用RP-HPLC法测定两种探针底物在大鼠肝微粒体孵育体系中的浓度;CO还原差示光谱法测定大鼠肝微粒体中CYP450酶含量;RT-PCR技术测定大鼠肝脏CYP1A2和CYP3A4酶基因m RNA表达量。结果:与空白组比较,芍药组CYP1A2酶活性有显著性差异(P0.05),芍药组CYP1A2酶m RNA表达量升高,有极显著差异(P0.01);附子芍药组对CYP1A2酶有诱导作用,有极显著差异(P0.01),附子芍药组CYP1A2酶m RNA表达量升高,有显著性差异(P0.05)。结论:附子配伍芍药能够诱导CYP1A2酶活性,增加CYP1A2酶基因m RNA表达量,加快附子毒性成分的代谢过程,进而达到附子的减毒作用。     

丙戊酸钠对慢性不可预见性温和刺激致抑郁大鼠行为学及下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能的影响

目的探讨丙戊酸钠对慢性不可预见性温和刺激(chronic unpredicted mild stress,CUMS)所致抑郁大鼠行为学及下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)功能的影响及其机制。方法将SD大鼠随机分为正常对照组(CG)、模型组(MG)、丙戊酸钠给药对照组(VCG)和丙戊酸钠给药模型组(VMG),每组15只。模型组采用孤养结合CUMS的方式建立大鼠抑郁模型,建模周期为28 d。VCG和VMG组灌胃给予丙戊酸钠300 mg/(kg·d),CG和MG组灌胃等体积的0.5%CMC-Na溶液。采用旷场试验和强迫游泳试验评价大鼠抑郁行为,试剂盒测定大鼠大脑皮层丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和血清皮质酮(concertmaster,CORT)含量,RT-PCR和Western blot法检测大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(corticotrophin releasing factor,CRF)基因m RNA和蛋白的表达水平。结果与CG组相比,MG组大鼠水平活动和垂直活动水平得分明显下降(P0.01),不动时间明显延长(P0.01),大脑皮层MDA含量明显升高(P0.05),SOD活力显著下降(P0.05),血清CORT含量明显升高(P0.05),下丘脑CRF基因m RNA及蛋白表达水平明显升高(P0.01及0.05);丙戊酸钠能够明显阻遏上述变化。结论丙戊酸钠能够明显改善CUMS大鼠的抑郁行为,改善机体氧化应激失衡,下调HPA轴功能。     

胆固醇在高脂高胆固醇诱导非酒精性脂肪性肝炎发生发展过程中的动态作用

目的探讨胆固醇在高脂高胆固醇诱导的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)发生发展过程中的动态作用。方法将SD大鼠随机分为CON组(正常饮食)、HFC0组(20%脂肪)、HFC1组(20%脂肪+1%胆固醇)、HFC2组(20%脂肪+2%胆固醇)及HFC5组(20%脂肪+5%胆固醇)。饲喂第4、6、8及12周末,采血并取肝脏组织;采用油酸(oleic acid,OA)及OA+低密度脂蛋白-胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)诱导人肝脏正常细胞(HL-7702)5 d后,构建NASH模型,同时以RPMI1640培养基(含10%FBS)为对照组。分别检测大鼠血浆及HL-7702细胞培养液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)的含量,大鼠肝脏组织及HL-7702细胞中总胆固醇(total cholesterol,TC)及甘油三酯(triglyceride,TG)的含量;HE及Masson染色观察肝脏组织病理改变;油红O及菲律宾菌素染色观察HL-7702细胞内脂滴及胆固醇含量;Western blot法检测活性n-固醇调节元件结合蛋白-2(n-sterol regulatory element binding protein 2,n-SREBP-2)、低密度脂蛋白受体(low-density lipoproteins receptors,LDLR)及3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGCR)的蛋白表达水平。结果动物水平:12周末,与CON组比较,HFC2组、HFC5组血浆中ALT、AST及肝脏组织中TC、TG含量均显著升高(P均<0.05),肝细胞脂肪变性、气球样变性及纤维化病变明显,HFC2组、HFC5组大鼠NASH诱导成功;经Western blot分析,4、6及8周末,HFC2组、HFC5组较CON组LDLR蛋白表达水平均显著升高(P均<0.05),12周末,HFC5组较CON组LDLR蛋白表达水平显著降低(P<0.05);4、6及8周末,各组n-SREBP-2蛋白表达水平与CON组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),12周末,HFC2组、HFC5组较CON组n-SREBP-2蛋白表达水平均显著升高(P均<0.05);4、6及12周末各组HMGCR蛋白表达水平与CON组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),8周末,HFC5组较CON组HMGCR蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。细胞水平:OA+LDL-C组较对照组及OA组细胞内胆固醇含量、n-SREBP-2及HMGCR蛋白表达水平均显著升高(P均<0.05);OA组及OA+LDL-C组较对照组LDLR蛋白表达水平均显著降低(P均<0.05)。结论胆固醇摄入量和摄入时间的长短与NASH肝损伤呈正相关;胆固醇可诱导肝细胞高表达LDLR,促使胆固醇进入肝脏增加,抑制HMGCR调控的内源性胆固醇合成;随着肝内胆固醇堆积增多,肝细胞LDLR表达减少,使肝内胆固醇相对不足,反馈性调节n-SREBP-2及HMGCR表达升高,打破肝脏胆固醇代谢稳态,促进了NASH的发生发展。     

柴胡皂苷b2对大鼠体内柴胡皂苷a肝组织分布的影响

研究柴胡皂苷b_2对柴胡皂苷a在大鼠肝脏组织中分布的影响。将Wistar大鼠随机分为两组,分别灌胃给药柴胡皂苷a(25 mg/kg)和柴胡皂苷a+柴胡皂苷b_2(25+3. 125 mg/kg)混合药液,然后于0. 25、0. 5、1、2、4 h收集肝脏,肝组织匀浆经液液萃取处理后通过LC-MS/MS法测定肝组织中柴胡皂苷a的含量。给药后0. 5 h,柴胡皂苷a在肝组织中分布量最大,并随时间延长其含量迅速下降。柴胡皂苷b_2显著增加0. 5 h时柴胡皂苷a在肝组织的累积量,而对其他时间点柴胡皂苷a在肝组织的累积量无显著性影响。本研究表明柴胡皂苷b_2增加了柴胡皂苷a在大鼠肝脏的分布,可能对药效产生影响。