高山被孢霉发酵产鸟苷酸二磷酸岩藻糖的研究

鸟苷酸二磷酸岩藻糖(GDP-L-Fuc)是一种重要的核糖类化合物,其作为岩藻糖基的受体具有重要的生理功能。尝试利用高山被孢霉发酵产GDP-L-Fuc。高山被孢霉经液氮研磨破壁,甲酸(含10%丁醇)溶液萃取后,利用高效液相色谱进一步分离得到了GDP-L-Fuc,并采用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱对结果进行定性分析。然后对高山被孢霉不同发酵时期GDP-LFuc产量进行分析,发现GDP-L-Fuc在氮源消耗之后仍然持续积累。同时,GDP-L-Fuc合成途径关键基因的转录水平在氮源耗尽时发生了上调,这表明氮源很可能是GDP-L-Fuc积累的关键因素。最后,在氮源耗尽后添加外源岩藻糖显著提高了GDP-L-Fuc的产量(50%),可达170.51μg/g。这为利用微生物发酵产GDP-L-Fuc奠定了理论基础。     

SSADH基因调控对高山被孢霉脂质合成的影响

高山被孢霉合成油脂能力很强,可合成多种n-3和n-6系列多不饱和脂肪酸(PUFAs)。γ-氨基丁酸(GABA)代谢途径是由谷氨酸经过一系列反应转化至琥珀酸并产生NADPH的过程,同时可为产油真菌生长提供碳源和氮源。通过构建γ-氨基丁酸途径中琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)基因RNA干扰菌株(MA-i SSADH),对MA-i SSADH中的脂肪酸组成、NADPH水平及相关基因转录水平进行分析,研究SSADH与高山被孢霉脂质合成关系。与原养型高山被孢霉(M.alpina)相比,MA-i SSADH中SSADH基因转录水平显著下调,同时脂肪酸总含量下降了20.9%,C18∶1相对含量提高了73.5%,表明SSADH在高山被孢霉脂质合成中起重要作用。尽管MAi SSADH中NADPH绝对含量没有发生显著性变化,但NADPH合成相关基因如苹果酸酶(ME)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、亚甲基四氢叶酸脱酸酶(MTHFD)基因转录水平均发生了显著变化,表明SSADH对NADPH合成途径产生了重要调控,这可能是其影响脂质合成的原因之一。     

高山被孢霉生产多不饱和脂肪酸发酵条件的研究进展

高山被孢霉能发酵生产多不饱和脂肪酸如花生四烯酸等,具有安全性好、产率高、生产易控制等优点,适宜于工业化生产。本文论述了高山被孢霉产多不饱和脂肪酸发酵条件的研究进展,着重于论述发酵过程中碳源、氮源、溶解氧及培养条件等对产物产率的影响作用研究。     

高山被孢霉发酵生产多不饱和脂肪酸的初步研究

高山被孢霉具有很强的脂肪合成能力,并可积累多种多不饱和脂肪酸,为进一步提高高山被孢霉多不饱和脂肪酸产量,对碳源、氮源等对高山被孢霉菌体生长和多不饱和脂肪酸(PUFA)生产的影响进行分析。研究结果表明:甘油可以作为葡萄糖的替代物用于高山被孢霉工业化发酵生产多不饱和脂肪酸;当脱脂豆粉与硝酸钾的比例为2∶1时,此时菌体形态最利于脂肪酸生产,脂肪酸和花生四烯酸的产量分别为11.20g/L和5.89g/L,花生四烯酸的产量提高了4.0倍。      

产油丝状真菌高山被孢霉中蝶呤类化合物的提取及检测

建立了高效液相色谱-荧光检测法同时测定高山被孢霉体内新蝶呤、蝶呤和生物蝶呤的方法。高山被孢霉在液氮破壁、酸性条件下经碘-碘化钾溶液氧化1h、滴加抗坏血酸还原液后,体内的四氢生物蝶呤及其前体二氢蝶呤三磷酸盐和6-丙酮酰四氢生物蝶呤分别被氧化成相应的氧化产物新蝶呤、蝶呤、生物蝶呤。经离子交换树脂纯化后,利用高效液相色谱进一步分离得到了氧化产物蝶呤、新蝶呤和生物蝶呤,并采用电喷雾质谱对定性结果进行确认。色谱柱为Inertsil ODS-3C₁₈（5μm,150mm×4.6mm）,用10mmol/L的磷酸氢二钠（pH6.0）作为流动相,流速为1.2mL/min,荧光检测器激发波长为350nm,吸收波长为450nm。检测出的新蝶呤、生物蝶呤和蝶呤的检出限依次是:0.003、0.002、0.005μg/mL。本方法能快速并准确的检测各类蝶呤类化合物,为利用高山被孢霉发酵生产四氢生物蝶呤奠定一定基础。      

高山被孢霉生产ARA发酵条件的优化研究

对ARA产生菌高山被孢霉的培养条件进行了研究,通过摇瓶实验考察了碳源、碳氮比、初始pH值、接种量和微量元素等对ARA的影响。结果发现在培养基中使用葡萄糖为碳源,碳氮比维持在40:1~50:1之间,初始pH6,接种量10%,添加VB1 100 mg/L、VB12 0.5 mg/L、生物素0.5mg/L、泛酸钙120 mg/L和谷氨酸1 g/L是较优配方(优化培养基A)。实验同时对比了使用单一氮源及混合氮源对高山被孢霉发酵产ARA的影响,结果发现使用混合氮源更有利于高山被孢霉发酵产ARA,混合氮源得到的ARA产量是使用单一氮源的2倍,且其含量占总油脂的44.5%,在此基础上获得优化培养基B。     

肉毒碱脂酰转移酶基因沉默对高山被孢霉脂质积累的影响

高山被孢霉是一种工业化生产多不饱和脂肪酸的产油真菌。通过分析高山被孢霉脂肪酸氧化途径中相关基因的转录水平,发现肉毒碱脂酰转移酶(carnitine acyl-transferase,CAT)基因与高山被孢霉脂肪酸氧化紧密相关,进一步利用RNA干扰技术实现在高山被孢霉中CAT基因的沉默,分析发现,在高山被孢霉重组菌中,CAT活性下调了33.3%,总脂肪酸积累量相比野生型菌株提高38.1%,表明通过抑制β氧化途径可以提高高山被孢霉的脂质积累量,这为推动高山被孢霉在脂质生物合成工业化方面的应用奠定了理论基础。     

高山被孢霉谷氨酸代谢调控产脂的初步研究

为解析谷氨酸代谢对产油丝状真菌高山被孢霉(Mortierella alpina)脂质合成的影响,该文考察了补加谷氨酸条件下高山被孢霉谷氨酸代谢相关酶的基因转录水平、酶活性水平和总脂产量等指标。结果显示,补加谷氨酸显著影响了高山被孢霉胞内谷氨酸代谢相关基因的转录水平,NADP⁺型谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶活性的增加为脂肪酸从头合成提供了充足的还原力,这使得细胞总脂含量提升了3 g/L(约占干重比例10%)。该研究为氨基酸介导的微生物脂质合成机制解析提供了参考。     

利用被孢霉发酵生产花生四烯酸工艺配方优化研究

利用高山被孢霉Mortierella alpina I49-N18发酵生产花生四烯酸。优化筛选出最适于高山被孢霉斜面培养、种子摇瓶培养以及摇瓶发酵培养的配方,稳定的培养基配方为后续发酵生产提供保障。通过培养基配方单因子试验分别对碳源、氮源、无机盐、氨基酸、植物油等原料的合适添加量进行初步确定,然后设计正交实验进行验证。考察初始葡萄糖浓度在高山被孢霉发酵生产花生四烯酸过程中对脂肪酸组分的影响,分析脂肪酸主要组分在发酵过程中的变化趋势。考察结果显示发酵培养基中补充添加800 1000mg/kg磷酸盐,添加600 1000mg/kg谷氨酸钠盐、添加0.04%0.12%植物油可以有效提高发酵生产花生四烯酸的产量。通过发酵工艺放大,在200m3发酵罐规模的发酵生产中得到应用,发酵产量得到大幅度提升,培养7d发酵生产花生四烯酸(ARA)的产量达到10g/L以上。     

高山被孢霉产花生四烯酸的发酵和老化工艺

高山被孢霉对于淀粉质原料具有优良的利用能力。采用经淀粉酶液化的玉米粉-豆粕培养基,研究了高山被孢霉在5 L容积机械搅拌罐液态发酵的主要参数,如搅拌转速和通气体积比对于高山被孢霉发酵产花生四烯酸的影响,得到最优的搅拌转速和通气体积比,分别为200 r/min和1∶1。研究发现,采用发酵罐培养5 d的菌丝体,最佳的老化温度和保温时间分别是20℃和5 d。本研究把谷物粗原料成功用于高山被孢霉发酵产花生四烯酸,经发酵罐优化和菌体老化后的花生四烯酸产量达到11.7 g/L,菌体老化可以在保持产量的同时缩短发酵周期,有效降低生产成本,有望实际用于花生四烯酸的工业化生产。