克氏担孢酵母脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

以克氏担孢酵母V3脂肪酶基因为研究对象,构建毕赤酵母稳定的高效表达系统。采用同源克隆法从克氏担孢酵母V3中获得一个脂肪酶基因,并将其构建到表达载体pPICZαA,转入毕赤酵母X33中,成功实现了克氏担孢酵母V3脂肪酶基因在毕赤酵母X33中的表达。重组工程菌摇瓶培养120 h后,酶活力可达18 U/mL。重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及质量浓度为1 g/100 mL的曲通-100、吐温-80、吐温-20对重组KLIP具有激活作用。重组酶的最适底物为三硬脂酸甘油酯（C18）。     

雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质研究

采用同源克隆法获得了雪白根霉的脂肪酶基因(rnl),将其连接到pPICZαA载体上,得到重组表达载体pPICZαA-rnl。将表达载体pPICZαA-rnl用限制性内切酶SacI线性化后,电击转入毕赤酵母X-33中。雪白根霉脂肪酶基因在毕赤酵母X-33中成功表达,重组菌株摇瓶培养144 h后,酶活可达48 U/mL。重组酶最适pH值为8.5,最适反应温度为35℃。1 mmol/L的Mn2+,Ca2+和K+以及1%的表面活性剂吐温20,吐温80,曲通100对重组脂肪酶具有激活作用。重组酶的最适底物为三月桂酸甘油酯(C12)。     

黑曲霉脂肪酶Lip A的异源表达与酶学性质分析

脂肪酶在油脂分解和脂质合成方面具有广泛应用，是一种很有前途的生物催化剂。该研究对来源于黑曲霉的脂肪酶Lip A进行了异源表达及催化特性研究。结果表明，该重组脂肪酶的最适温度为50℃,最适pH为8.0,并且在40～60℃和pH 5.0～8.0有较好的稳定性。该酶对有机试剂有较好的耐受性，金属离子Ca²⁺和Mg²⁺对脂肪酶水解活性有促进作用，Fe³⁺、Zn²⁺和Cu²⁺严重抑制该酶活性。反应动力学参数表明，对硝基苯酚乙酸酯是脂肪酶Lip A的最适底物，其反应K_m为(0.228±0.05) mmol/L,催化常数K_cat为(0.023±0.001) s^-1。生物信息学分析表明，脂肪酶Lip A是abH23同源家族Rhizomucor mihei脂肪酶中的一员。黑曲霉脂肪酶Lip A具有催化乳酸和乙醇生成乳酸乙酯特性，为其在酿造领域的应用奠定了基础。     

米黑根毛霉脂肪酶基因的酵母重组表达和Kex2位点改造

米黑根毛霉脂肪酶(RML)具有较高的合成活性、热稳定性、溶剂耐受性以及sn-1,3位置专一性等一系列适合工业化推广的特点。本研究通过密码子优化改造RML编码基因,并将其克隆、转化到毕赤酵母GS115菌株,经诱导发酵156 h,酶活达到3.77 U/mL。为了进一步改善RML脂肪酶的重组表达,通过定点突变的方式去掉潜在的Kex2酶切位点,结果显示:RML突变体表达量均显著低于野生型的RML脂肪酶,表明"-Arg196-Arg197-"序列并不影响RML的重组表达。通过对RML蛋白结构分析,Kex2酶切位点的肽键被包埋在蛋白内部,这表明该位点区域的折叠在进入分泌途径时已基本完成。本研究对异源蛋白的酵母重组表达具有一定参考价值。     

裂殖壶菌脂肪酶基因克隆及底物特异性研究

裂殖壶菌甘油三酯合成和水解的过程中,脂肪酶起着重要的作用。根据同源性分析结果,筛选得到裂殖壶菌脂肪酶基因STGL2。以cDNA为模板获得STGL2脂肪酶基因,将其连接到pPIC9K载体上,得到重组质粒pPIC9K-STGL2,并在毕赤酵母中表达;系统分析了重组脂肪酶(Stgl2p)的底物特异性。结果表明:STGL2脂肪酶基因在毕赤酵母中成功表达;裂殖壶菌脂肪酶Stgl2p的最适底物为对硝基苯酚月桂酸酯(p-NPL),其最适p H为7.5,最适反应温度为35℃。综上所述,脂肪酶Stgl2p在裂殖壶菌细胞内对甘油三酯中长碳链脂肪酸的水解起着重要的作用。     

抗辐射不动杆菌碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

本研究将来自抗辐射不动杆菌CMC-1的碱性脂肪酶基因去掉信号肽,经密码子优化及全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了重组质粒pPICZαA-ARL,质粒线性化后转化毕赤酵母X33,筛选得到分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X33/pPICZαA-ARL。摇瓶发酵液上清酶活最高达65 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为50℃,最适pH为9.0,最适底物是对硝基苯酚辛酸酯。     

外源脂肪酶在毕氏酵母表面展示及发酵过程分析

分别考察基于絮凝素和凝集素2种不同展示系统,展示有外源脂肪酶CALB(Candidan Antarctica lipase B)的重组展示酵母的展示酶活、上清酶活,发现毕赤酵母作为宿主在外源脂肪酶展示过程会分泌目的蛋白至上清中,引起"外泄",进一步通过重组展示酵母外源蛋白鉴定、外源蛋白去糖基化、发酵过程中蛋白变化趋势观察,表明基于絮凝素系统的非共价锚定是引起展示过程中蛋白外泄比例过高的主要原因,研究为实现脂肪酶在毕赤酵母细胞的高效展示进而提高展示酶的催化效率提供了理论指导。     

Thermoanaerobacter sp. X514嗜热脂肪酶LipTX的异源表达与酶学性质研究

本文克隆表达了来源于嗜热细菌Thermoanaerobacter sp.X514的嗜热脂肪酶Lip TX基因(Teth514_0029),利用亲和层析纯化了脂肪酶Lip TX,并详细研究了该脂肪酶的酶学性质。采用PCR技术扩增脂肪酶Lip TX基因,克隆到载体p ET15b中,构建重组载体p ET15b-Lip TX;将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中并利用IPTG诱导表达目的蛋白,经70℃热处理和Ni-NTA亲和层析两步纯化,得到纯化的重组酶。SDS-PAGE结果表明,脂肪酶Lip TX分子量为28 ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度和pH分别为70℃和7.5;通过水解底物特异性和动力学实验,发现LipTX可以水解不同长链酰基(C_8-C_(12))的对硝基苯酚酯底物,对硝基苯酚癸酸酯是该酶最适合底物;同时该酶能够水解链长在C_4到C_(16)范围的三甘油酯底物,其中以甘油三丁酸酯为底物的酶活力最高。该酶对非极性有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、DMF、DMSO和正己烷和氯仿)和变性剂(SDS、Tween-20和Triton X-100)具有较强的抗性,因此在生物催化和有机化学合成中具有广阔的开发应用前景。     

皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1在毕赤酵母中的高效表达及其催化合成维生素E醋酸酯

本研究将经密码子优化的皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase) CRL1基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHKA,构建得到重组菌株GS115/pHKA-CRL1;经摇瓶发酵并结合甲醇诱导120 h处理,该菌株对底物对硝基苯酚丁酯(p NPB)的水解活力达到39.73 U/mL。通过对AOX1启动子和α分泌信号肽同时进行改造,进一步获得重组菌株GS115/pHKA-AOX1m/αm-CRL1,其脂肪酶活力提高达到63.63 U/mL。发酵液上清液经超滤浓缩、硫酸铵沉淀后,再经脱盐和阴离子交换层析处理,获得纯化的重组CRL1。该纯化工艺的纯化倍数为5.41倍,回收率为33.81%。而纯化重组CRL1的比酶活为984.5U/mg。重组CRL1的最适温度为40℃,最适pH为7.5;经40℃保温6 h,仍保留52.99%的相对活力;在偏酸性环境中较为稳定。以摇瓶发酵、真空冷冻干燥后的重组CRL1为催化剂,在无溶剂体系中催化合成维生素E醋酸酯,在最适反应条件下(200 mg D-α-生育酚、1 mL乙酸酐、100 mg CRL1、反应温度60℃、转速200 r/min、反应时间9 h),D-α-生育酚的转化率在97.00%以上。     

基于组合优化策略在毕赤酵母中高效表达杜邦嗜热菌脂肪酶北大核心CSCD

杜邦嗜热菌脂肪酶(LIP1)是一种在洗涤行业、生物柴油制备、油脂改性等领域具有良好应用潜力的碱性脂肪酶,然而其天然产量极低,难以满足产业化需求。采用组合优化策略筛选出高效表达LIP1的毕赤酵母重组菌株。首先,构建毕赤酵母密码子偏好性优化的LIP1基因,通过高浓度G418抗性平板和BMMY-罗丹明B定性平板筛选出脂肪酶活性较高的重组菌株;其次,利用信号肽优化和分子伴侣共表达优化筛选得到一株高效表达的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1,采用碱滴定法测定其酶活,采用比色法测定其底物特异性。结果表明,经组合优化策略筛选出的菌株在摇瓶和5 L发酵罐中发酵最高分泌酶活分别达到1 136 U/mL和12 150 U/mL。底物特异性结果显示重组脂肪酶LIP1最适底物为C8链长的对硝基苯酚酯。综上所述,基于组合优化策略实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达,为未来LIP1的产业化奠定基础。     

Probiotics and prebiotics--perspectives and challenges

Owing to their health benefits, probiotics and prebiotics are nowadays widely used in yogurts and fermented milks, which are leader products of functional foods worldwide. The world market for functional foods has grown rapidly in the last three decades, with an estimated size in 2003 of ca US$ 33 billion, while the European market estimation exceeded US$ 2 billion in the same year. However, the production of probiotics and prebiotics at industrial scale faces several challenges, including the search for economical and abundant raw materials for prebiotic production, the low-cost production of probiotics and the improvement of probiotic viability after storage or during the manufacturing process of the functional food. In this review, functional foods based on probiotics and prebiotics are introduced as a key biotechnological field with tremendous potential for innovation. A concise state of the art addressing the fundamentals and challenges for the development of new probiotic- and prebiotic-based foods is presented, the niches for future research being clearly identified and discussed.     

壳聚糖及其衍生物作为果蔬保鲜剂和食品助剂的研究进展及应用

介绍了壳聚糖及其衍生物涂膜延缓果蔬衰老软化的可能机制,涂膜与果蔬贮藏期间品质、生理关系,常见的果蔬壳聚糖处理的最佳浓度和效果的研究进展,以及壳聚糖及其衍生物作为食品加工助剂的研究和应用.     

常用消毒灭菌法及其机理与应用

介绍了采用消毒灭菌方法,有加热消毒法,紫外线辐射法和化学药剂消毒法。常用化学药剂有醛类、含氯消毒剂、醇类消毒剂以及高锰酸钾、生石灰等,阐释了消毒与灭菌两个概念的区别。     

壳聚糖及其衍生物涂膜保鲜果蔬和食品的研究进展及应用

本文介绍了壳聚糖及其衍生物涂膜延缓果蔬衰老软化的可能机制,涂膜与果蔬贮藏期间品质、生理关系,常见果蔬壳聚糖处理的最佳浓度和效果的研究进展。最后对壳聚糖及其衍生物在食品的涂膜保鲜方面也做了综述。     

毛霉型低盐速成豆豉工业化生产工艺与设备

本文介绍了毛霉型低盐速成豆豉的工业化生产工艺及生产线的关键设备。     

国家标准、行业标准的立项与制定的程序和要求

根据GB/T 20000.1-2002<标准化工作指南 第1部分:标准化和相关活动的通用词汇>中的定义,标准是"为了在一定范围内获得最佳秩序,经协商一致制定并由公认机构批准,共同使用的和重复使用的一种规范性文件".     

蓝莓的营养保健功能及其开发利用

蓝莓因营养丰富和具有良好的保健功能而被广泛研究,其不仅富含蛋白质及钙、铁、锌和维生素等微量营养素,而且含有全部必需氨基酸和许多功能因子。草莓具有改善人类营养水平和预防疾病发生的潜在功效,得到了国内外农业及食品科研机构的广泛关注。本文详细的概述了蓝莓的营养价值以及保健功能,同时分析了蓝莓开发利用应关注的问题,并提出了相应的建议。      

海洋动植物油脂的开发与利用

中国有广阔的海洋 ,丰富的海洋资源 ,海洋动植物油脂是 2 1世纪中国油脂工业的新油源。通过对海洋动植物油脂资源的调查 ,分析了海洋动植物油脂结构、成分、氧化与抗氧化及其营养价值 ,对海洋动植物油脂在基因改良、超细微保健以及海洋水产品综合利用方面进行了探讨 ,并对海洋动植物油脂开发技术进行了探讨     

导电和耐热纤维及纱线

法国R．Stat公司活跃在导电纤维市场已有20年之久,但是,办公室雇员、宾馆客人、飞机乘客、在易爆炸环境中工作的人员、木材或纸浆工业操作人员、消防队员和军人,由于得益于R．Stat公司生产的导电纤维的保护,而免遭令人不舒服的电击,或者免遭火灾和爆炸的伤害,这些却无人知晓。