19F型肺炎链球菌菌种的复壮及其荚膜多糖纯化工艺的优化

目的开发复壮肺炎链球菌19F型(Sreptococcus pneumoniae serotype 19F,简称PN19F)菌种的方法,并优化其荚膜多糖的纯化工艺。方法配制PN19F菌种用液体扩增培养基和固体选择培养基,筛选出荚膜较厚的单菌落,比较复壮前后PN19F菌种的发酵培养情况、纯化后多糖收获量及多糖质量;将发酵液裂解后分别酸沉淀8、24和48 h,并经100 KD超滤纯化,再分别用乙醇法和冻干法制备精制多糖,比较其多糖收获量、组分检定结果、抗原活性、核磁共振图谱。结果两种培养基复壮前后的PN19F菌种,发酵收获菌液A600值及培养时间变化不大。纯化后多糖收获量分别为0. 2和0. 6 g/L,即复壮后多糖收率提高了195%。酸沉淀8、24 h后纯化的多糖质量合格,且24 h较8 h多糖收率高约38%,酸沉淀时间达48 h时,产率无明显变化,但多糖质量不合格。乙醇法和冻干法制备的精制多糖各项指标均合格,且无明显差异。结论应用制备的两种培养基复壮的PN19F菌种,可明显提高荚膜多糖产量。PN19F菌种的酸沉淀时间不超过24 h,乙醇法和冻干法均可用于精制多糖制备。     

23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制

目的　研制 2 3价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗。方法　采用 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、2 0、2 2F、2 3F和 33F等 2 3型肺炎链球菌进行大罐培养和荚膜多糖的纯化 ,制备出 2 3价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗。结果　经检定其主要质量指标均符合欧洲药典 (1997年版 )要求。结论　已建立起较为成熟的培养及纯化工艺 ,具备了规模化的生产条件     

肺炎链球菌荚膜多糖分子大小及分子量分析方法的比较

目的 3种方法分析10个血清型肺炎链球菌荚膜多糖(pneumococcal capsular polysaccharides,Pn Ps)样品的分子大小及分子量,并对这3种方法进行比较。方法采用Sepharose CL-4B凝胶排阻层析(SEC)技术检测1型、2型、4型、8型、9N型、12F型、14型、18C型、19A型和23F型Pn Ps各2~3批次样品在色谱柱中的分配系数(KD)和样品组分特征;采用高效凝胶排阻色谱-示差折光检测器(high performance size-exclusion chromatography with refractive index,HPSEC-RI)法建立Pullulan标准品分子量标准曲线,计算各Pn Ps样品的重均分子量(weight-average molecular weight,Mw);采用高效凝胶排阻色谱-多角度激光光散射仪/示差折光检测器联用技术(high performance size-exclu-sion chromatography with multi-angle laser light scattering and refractive index,HPSEC-MALLS/RI)检测各Pn Ps样品的Mw、数均分子量(number-average molecular weight,Mn)、多分散水平(Mw/Mn)及均方根旋转半径(root mean square ratio of gyration,Rg);对HPSEC-RI法和HPSEC-MALLS/RI法检测Pullulan分子量标准品的结果进行比较。结果 SEC技术不同化学方法检测的同批次Pn Ps样品的KD值十分接近,且主峰形态也比较近似,个别批次Pn Ps不同化学方法获得的峰形有差别。经HPSEC-RI检测Pullulan分子量标准品获得的回归方程为y=-0.278 x+10.13,r2=0.998,各Pn Ps样品的分子量为1.812×105~1.246×106。HPSEC-MALLS/RI联用技术检测的各批Pn Ps样品的Mw分布于9.898×105~1.471×105,Rg为84.9~25.4 nm,同一血清型不同批次样品Rg间的大小关系与其Mw间的大小关系具有较好一致性。结论结合多种方法检测多糖样品的分子大小和分子量,可更客观、全面地了解Pn Ps分子的各种性质。     

多价肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗的研究进展

肺炎链球菌是人类致病率及死亡率极高的致病菌之一,严重威胁人类的生命健康。肺炎链球菌荚膜多糖具有良好的免疫原性,可激发机体产生保护性抗体,但单纯的荚膜多糖疫苗不能诱导产生免疫记忆抗体,将多糖与载体蛋白结合后可诱导产生记忆性抗体,有效提高疫苗的免疫原性,预防肺炎链球菌入侵性疾病。目前,7、10及13价肺炎链球菌多糖-蛋白结合疫苗（简称肺炎结合疫苗）已相继问世,15及20价肺炎结合疫苗处于临床研发阶段。本文就肺炎结合疫苗研发、制备方法、免疫原性影响因素及国内接种情况等方面的研究进展作一综述。     

响应面法优化14型肺炎链球菌荚膜多糖的超滤工艺

目的利用响应面法优化14型肺炎链球菌荚膜多糖的超滤工艺。方法选择跨膜压力、切向流量及多糖浓度为自变量,膜包处理能力为响应值,采用Box-Behnken设计分析各自变量及其交互作用对膜包处理能力的影响;利用Design Expert软件对数据进行回归分析,得到回归方程的预测模型,取3批14型肺炎链球菌荚膜多糖水溶液,对优化的工艺参数进行验证;按照最佳超滤工艺对3批14型肺炎链球菌荚膜多糖水溶液进行等体积透析,确定超滤终点;并对纯化的荚膜多糖进行各项检定。结果优化的14型肺炎链球菌荚膜多糖超滤工艺为:跨膜压力12.8 Psi,切向流量66 L/h,多糖浓度0.86 g/L,最适透析倍数为5倍,在该条件下,膜包处理能力的理论值为91.7 g/(h·m2),实际值为91.9 g/(h·m2)。3批纯化的14型肺炎链球菌荚膜多糖水溶液的多糖组分均符合《欧洲药典》7.0版相关规定,均未检出残余脱氧胆酸钠和乙醇,3批多糖的相对分子质量均大于420 000,抗原性良好,且抗原物质成分无差异。结论响应面法优化的14型肺炎链球菌荚膜多糖超滤工艺显著提高了工作效率,降低了生产成本,为14型肺炎链球菌荚膜多糖的规模化生产提供了实验依据。     

新型肺炎球菌荚膜多糖纯化方法的建立

目的建立一种无乙醇、无苯酚的新型肺炎球菌荚膜多糖纯化方法。方法以1型、6B型、14型肺炎球菌为模式样品,将发酵培养液依次用脱氧胆酸钠和核酸酶进行处理,以实现荚膜多糖与杂质的分离。再将此工艺应用于其他型别肺炎球菌发酵培养液纯化,获得纯化荚膜多糖。结果 1型、6B型、14型肺炎球菌在纯化过程中核酸、蛋白的去除率均在99%以上,多糖回收率高于80%。应用此方法纯化的各型荚膜多糖各项指标均符合《欧洲药典》9.0版标准。结论该纯化方法适用于肺炎球菌荚膜多糖的规模化生产,且无血清型别限制,可替代传统的乙醇苯酚纯化工艺。     

CDAP活化多糖制备5型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗

目的用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)代替溴化氰(CNBr)活化5型肺炎链球菌荚膜多糖,制备5型肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(TT)结合疫苗。方法将5型肺炎链球菌荚膜多糖溶液加CDAP活化,经ADH和缩合剂EDAC与破伤风类毒素进行偶联,经凝胶过滤柱层析纯化,得到5型肺炎链球菌多糖-TT结合物,并对其生化指标、血清学特异性、安全性及免疫原性进行检测。结果多糖-TT结合物的游离多糖含量与多糖的衍化率成反比;血清学特异性良好;经动物实验证明其安全性合格;具有良好的免疫原性,且游离多糖含量越低,免疫原性越强。结论用CDAP活化工艺制备的5型肺炎链球菌荚膜多糖-TT结合物适宜制备疫苗。     

多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物对小鼠免疫应答的影响

目的探讨多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物对小鼠免疫应答的影响。方法分别用单一载体(破伤风类毒素)和混合载体(破伤风类毒素和白喉类毒素)作为多糖结合物的载体蛋白,制备5～9价肺炎链球菌荚膜多糖结合物,免疫NIH小鼠,采用间接ELISA法测定免疫小鼠血清中抗荚膜多糖特异性IgG抗体水平。结果多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫效果优于相应的单价结合物;随着结合物配制价数的增高,小鼠的免疫应答能力趋于下降;多价结合物中使用两种载体能缓解此现象,但载体含量过高时,依然会抑制免疫应答。结论多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物免疫小鼠后,随着载体剂量的增高,会出现载体诱导的表位抑制现象,使小鼠的免疫应答反应减弱。两种载体蛋白同时使用能缓解此现象。     

肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠抗体应答的比较

目的比较肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠的抗体应答。方法选NIH小鼠,分别经皮下和腹腔途径免疫3次同等剂量的结合疫苗,每次间隔2周,用ELISA方法检测两种途径免疫小鼠的血清抗体滴度。结果结合疫苗经腹腔免疫后的抗体滴度优于皮下免疫。小鼠经腹腔免疫3次后,血清抗体的几何平均滴度分别是第1次免疫的6·6倍和3·5倍。结论结合疫苗经腹腔免疫较皮下免疫获得的抗体应答水平高。     

肺炎链球菌补体结合蛋白C3-BP的纯化及其免疫效果

目的对9V型肺炎链球菌补体结合蛋白C3-BP进行纯化及免疫效果分析。方法通过三氧醋酸沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等方法,从9V型肺炎链球菌培养上清中提取C3-BP,Lowry法检测其浓度,SDS-PAGE检测其纯度及大小,Western blot检测其补体C3结合活性。将纯化蛋白免疫NIH小鼠,ELISA法测定小鼠血清IgG抗体,MTT法测定小鼠脾淋巴细胞增殖情况,活菌攻击,检测其交叉保护效果。结果经纯化的表面蛋白C3-BP,其相对分子质量约为90 000,为单链蛋白,浓度为0.21 mg/ml,纯度为90.7%,具有与补体C3结合的特性。免疫小鼠后,抗体滴度达到1∶38 802。免疫组小鼠脾脏与胸腺淋巴细胞代谢活性明显增强,与对照组相比,二者刺激指数之间差异有显著意义。9V型C3-BP免疫小鼠后,不仅对9V型肺炎链球菌株有保护作用,对2型、6B型和14型肺炎链球菌菌株也有保护作用。结论摸索出了一种纯化肺炎链球菌表面蛋白C3-BP的方法,纯化的C3-BP具有不依赖血清型的交叉保护作用,而且体液免疫及细胞免疫效果良好。     

22F型肺炎球菌荚膜多糖的活化及其多糖蛋白结合物的免疫原性

目的用不同活化剂进行22F型肺炎球菌荚膜多糖(type 22F streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide)的活化,并探讨其多糖蛋白结合物的免疫原性。方法分别用溴化氰(cyanogen bromide,CNBr)和1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)作为22F型肺炎球菌荚膜多糖的活化剂,1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)作为链接剂,制备22F型肺炎荚膜多糖衍生物(3批Pn22FpsADH1和3批Pn22Fps-ADH2);在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的作用下,将衍生物与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)共价结合,经凝胶过滤柱层析纯化,得到22F型肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物(3批Pn22Fps-TT1和3批Pn22Fps-TT2);并对其生化指标、血清学特异性、免疫原性及异常毒性进行检测。结果衍生物Pn22Fps-ADH2的衍生率及回收率均略高于Pn22Fps-ADH1;结合物Pn22Fps-TT2的生化指标检测结果相对Pn22Fps-TT1较好;结合物Pn22Fps-TT1和Pn22Fps-TT2均可与22F型肺炎球菌诊断血清特异性结合;结合物Pn22Fps-TT1和Pn22Fps-TT2均具有良好的免疫原性;无异常毒性。结论 CNBr和CDAP均可作为22F型肺炎球菌荚膜多糖活化剂,经活化和结合反应,其抗原位点得到较好保留,但CDAP作为结合疫苗多糖的活化试剂效果更佳。     

基于QbD理念优化5型肺炎球菌荚膜多糖层析纯化工艺及验证

目的基于质量源于设计(quality by design,QbD)理念优化并验证5型肺炎球菌荚膜多糖层析纯化工艺的设计空间。方法以样品处理量(sample handling capacity,SHC)、多糖回收率(polysaccharide recovery rate,PRR)为关键质量属性(critical quality attributes,CQAs),通过部分析因试验确定p H、氯化钠浓度、多糖浓度为关键工艺参数(critical process parameters,CPPs),再通过Box-Behnken设计优化CPPs,基于二次多项式回归模型建立设计空间,并进行验证。结果方差分析结果显示,模型的P均0. 000 1,且失拟值均 0. 05,表明该模型可较好地描述CQAs和CPPs之间的关系。最终获得的操作空间为:pH 7. 7～7. 9,氯化钠浓度220～280 mmol/L,多糖浓度1～1. 6 mg/mL。结论基于Qb D理念优化的5型肺炎球菌荚膜多糖层析纯化工艺设计空间可提高工艺过程的稳健性和灵活性。     

b型流感嗜血杆菌荚膜多糖定量~1H-NMR法的建立及验证

目的建立测定b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)荚膜多糖绝对含量的定量~1H核磁共振法(nuclear magnetic resonance,NMR,即~1H-NMR法),并进行验证。方法精密称取Hib荚膜多糖粉末,重水溶解,配制一定浓度的供试品多糖溶液;采用Bruker Avance-600型超导核磁共振波谱仪,设置NMR实验参数条件,以重水为溶剂,二甲基砜为内标物建立定量~1H-NMR法进行多糖含量测定;对该方法进行专属性、准确度、线性、精密度及耐用性验证;应用建立的定量~1H-NMR法及化学法测定5批Hib荚膜多糖含量。结果经~1H-NMR谱、~(13)C-NMR谱、~1H-~1H COSY谱及~1H-13C HSQC谱归属显示,Hib荚膜多糖的定量峰(δ_(H)5. 06)及内标物二甲基砜的定量峰(δ_(H)3. 14)分离良好,互不干扰,且不受样品内其他谱峰的干扰,方法专属性良好;供试品溶液加入100、150及200μL国际标准品,加标回收率在101%～102%;Hib多糖质量浓度在1～20 mg/mL范围,线性方程为y=0. 234 3 x-0. 002 6(R~2=1. 000 0);供试品溶液6次重复性及中间精密度测定的定量峰积分面积比值的RSD分别为0. 78%及0. 60%,精密度良好;5 mg/mL的供试品溶液在不同脉冲角度及不同延迟时间定量峰积分面积比的RSD分别为0. 07%及0. 13%,耐用性良好。5批荚膜多糖经定量~1H-NMR法及化学法检测,核糖含量均在《中国药典》三部(2015版)规定合格范围内(320～410 mg/g)。结论成功建立了测定Hib荚膜多糖含量的定量~1H-NMR法,该方法具有良好的专属性、准确度、线性、精密度及耐用性,为Hib疫苗的质量控制研究奠定了基础。     

伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺的优化

目的优化伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺,以替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法。方法采用DEAE离子交换层析柱,分别在缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl)pH值为6.0、7.0和8.0的条件下纯化1批伤寒Vi多糖粗糖,并与传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法进行比较。按《中国药典》三部(2010版)要求检测纯化样品的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小及内毒素含量,并计算样品的多糖回收率。采用优化的DEAE柱层析纯化工艺纯化3批伤寒Vi多糖粗糖,验证该工艺的稳定性。结果 DEAE离子交换柱缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl)pH值为7.0和8.0时,可有效将伤寒Vi多糖的杂质与纯化产物分离,多糖回收率分别为36.52%和38.35%,明显高于传统工艺的多糖回收率(15.52%),且纯化产物的内毒素含量(10 EU/μg)明显低于传统工艺(200 EU/μg)。以优化工艺(pH 7.0)纯化3批伤寒Vi多糖粗糖获得的6批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小、内毒素含量及多糖回收率差异较小,标准偏差均小于5%。结论优化了伤寒Vi多糖柱层析的纯化工艺,该工艺稳定性良好,可替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi多糖的纯化。     

9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中游离多糖含量检测方法的建立

目的建立测定9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中游离多糖含量的检测方法。方法对9V型肺炎球菌多糖溶液进行不同浓度的脱氧胆酸钠(NaDOC)酸沉处理,选择仅沉淀结合物而不沉淀多糖的最佳处理条件,筛选出所能沉淀蛋白的最大浓度;对建立的方法进行准确度、精密度、专属性及线性验证。结果 9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液的最佳NaDOC酸沉处理条件为2%NaDOC-0. 05 mol/L HCl;蛋白浓度低于200μg/m L时,NaDOC酸沉处理条件沉淀蛋白的效果最佳。准确度试验的回收率在90%～99%之间;实验内及实验间均具有良好的精密度(CV均小于10%);在10～100μg/mL范围内采用蒽酮硫酸法测定糖浓度的曲线,线性良好,r~2> 0. 998;NaDOC的终浓度在0. 25%以下,对蒽酮硫酸法检测无干扰。结论 NaDOC酸沉淀法能很好地分离结合物原液中的结合物与游离多糖,具有良好的重复性和准确性,可用于测定9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中的游离多糖含量。     

层析法纯化脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖工艺的建立

目的建立一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺。方法将A、C、Y、W135群粗糖样品溶解后,用含2%脱氧胆酸钠(SDC)的Tris-HCl缓冲液稀释,用串联的Capto Adhere和Capto DEAE介质,采用流穿模式,经一步层析将多糖与其他杂质分离,再经Sephodex G25脱盐后获得精糖原液,根据《欧洲药典》7.0的方法和标准,对各型样品的各项指标进行检测。结果 4群多糖均可在柱上流穿,多糖可与蛋白及核酸完全分离;纯化多糖样品的各项指标均符合《欧洲药典》标准,各群多糖的回收率均高于55%。结论建立了一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺,缩短了生产时间,提高了回收率,可替代传统的苯酚抽提工艺,用于脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖的纯化。     

肺炎球菌荚膜多糖中氨基己糖基团定量检测方法的优化及验证

目的优化肺炎球菌荚膜多糖中氨基己糖基团的定量检测方法,并进行验证。方法对肺炎球菌荚膜多糖中氨基己糖基团定量检测方法的水解条件(盐酸溶液分别为4、8、10 mol/L,时间分别为0.5、1、2、4、4.5、5、6 h)和乙酰化条件(温度分别为80、90、100℃,时间分别为30、45、60、90、120 min)进行优化,并验证该方法的专属性、线性、准确性、精密性及耐用性。结果最佳水解条件为10 mol/L盐酸溶液水解2 h;最佳乙酰化条件为90℃水浴45 min。该方法可特异性检测肺炎球菌荚膜多糖中氨基己糖的含量;D-盐酸氨基葡萄糖对照品溶液浓度在100~500μg/ml时,与A_(530)值呈良好的线性关系,R~2均0.99;3次检测11个血清型肺炎球菌荚膜多糖样品的加标回收率均在90%~110%间;该方法的重复性及中间精密度的变异系数(CV)均2%;6份D-盐酸氨基葡萄糖对照品溶液乙酰化不同时间的CV值为1.3%~5.2%。结论该方法具有良好的专属性、线性、准确性、精密性及耐用性,可用于肺炎球菌荚膜多糖中氨基已糖含量的检测。     

无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立

目的建立适合大规模生产的无细胞百日咳疫苗(Acellular pertussis vaccine,APV)纯化新工艺,使疫苗主要成分的比例稳定可控。方法复苏百日咳菌种并传代培养,在大罐发酵培养收获前,调整菌液的pH值至弱酸性,再通过离心获得上清液,经超滤浓缩和脱盐处理,使用阳离子交换层析进行目的组分的分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE分离并经Western blot鉴定,确定最佳纯化条件。用建立的层析纯化新工艺连续纯化3批APV,检测各项指标,验证该工艺的重复性。结果收获前菌液pH值调至5.8～6.0,可使疫苗主要保护抗原在上清液中的含量明显提高;采用强阳离子交换层析的方法,从目的蛋白的捕获到多组分的分离提纯可一步完成,各目的蛋白组分的纯度均可达85%以上,回收率可达90%以上;建立的纯化新工艺具有良好的重复性。结论初步建立了可线性放大、适合APV大规模生产的层析纯化新工艺,为疫苗质量标准的提高奠定了基础。