产木聚糖酶毕赤酵母工程菌株构建及表达条件优化研究

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn43A成熟肽基因插入表达载体p PIC9K,重组质粒SalⅠ线性化后分别电击转化2种毕赤酵母GS115和KM71,转化液经MD平板、G418浓度梯度平板和摇瓶复筛,获得两株重组菌GS115/Xyn43A(Mut~+)和KM71/Xyn43A(Mut~s)。其中GS115/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度2.0%,接种时间24 h,诱导时间108 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.3;KM71/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度1.75%,接种时间26 h,诱导时间132 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.5。在最优表达条件下两重组菌GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A比酶活力分别可达139.36、143.29 U/mg。     

碱性木聚糖酶在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

将教酒链霉菌L1105第10家族碱性木聚糖酶基因去除纤维素结合域(CBD)后将功能结构域基因xynAe SC克隆到毕赤酵母表达载体。经筛选得到重组工程菌GS1153-20,用甲醇诱导后产酶活力达到最高683±9U/m L。结果表明,重组木聚糖酶的最适p H为7.2,且在p H 6.2~8.6有较高的相对酶活;其最适温度为70℃,40~60℃时相对酶活力都在70%以上;重组酶Xyn Ae SC以燕麦木聚糖为底物时,酶活力最高,相对酶活力为桦木的259.7%±10.7%;对甘蔗渣木聚糖的酶活力最低,只有对桦木木聚糖酶活的16.0%±1.5%。研究表明,碱性木聚糖酶基因成功地在毕赤酵母中表达,且去除CBD域后,其酶学性质并未改变。     

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在毕赤酵母中的高效表达

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2(成熟肽碱基)插入表达载体p PIC9K中,SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经MD平板、G418梯度和摇瓶复筛筛选出多克隆阳性转化子。选择28h的种子,每隔24h补加1.5%的甲醇,发酵96h后,比酶活可达13210U/mg;SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为23.0ku;重组酶最适作用温度为45℃,最适作用p H为5.0,在温度35~40℃、p H5~7条件下有良好的稳定性,Ca2+对酶的激活作用最明显。     

耐热赖氨酸氨肽酶毕赤酵母表达及培养条件优化

为实现耐热耐氨酸氨肽酶的异源表达,通过PCR扩增技术从Pseudomonas aeruginosa NJ-814基因组中克隆获得耐热的赖氨肽酶基因(PLAP),构建重组载体p PIC9K-PLAP,并最终实现在毕赤酵母GS115中的分泌表达。对重组毕赤酵母进行初步筛选,单因素实验优化获得重组毕赤酵母最佳诱导条件如下:诱导培养基初始pH为5.0、甲醇质量浓度1.5 g/dL、诱导温度28℃、装液量25 mL/250 mL、Co~(2+)浓度50μmol/mL、山梨醇添加量9 g/L。在最优条件下,氨肽酶酶活提高了5.2倍,比酶活2.74 U/mg。实验结果表明:PLAP基因已成功转入毕赤酵母GS115并获得表达。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115中的异源表达

目的构建毕赤酵母基因工程菌,以实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。方法人工合成朱黄青霉HI-4的α-1,6-葡聚糖酶基因ZHdex,克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电转入毕赤酵母GS115。甲醇诱导目的蛋白表达。结果成功在毕赤酵母GS115中对ZHdex基因进行表达,SDS-PAGE表明重组毕赤酵母在66×103附近有目的蛋白表达,与理论值一致。在摇瓶水平,甲醇诱导培养120 h后,α-1,6-葡聚糖酶的最高酶活达28.79 U/mL,蛋白质浓度为0.56 mg/mL。结论获得一株重组毕赤酵母GS115-ZHdex,其产物具备α-1,6-葡聚糖酶活性,成功地实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。     

毕赤酵母表达蒜酶及其体外抗氧化功能研究

从大蒜鳞茎中克隆蒜酶基因,构建蒜酶真核表达载体,并在毕赤酵母系统中诱导表达,探讨重组蒜酶的活性及其催化蒜氨酸分解产生蒜素的抗氧化活性。利用RT-PCR方法克隆大蒜鳞茎蒜酶基因,通过p PIC9K载体构建p PIC9K-alliinase真核表达质粒,电转化法导入毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆,经甲醇诱导后取发酵上清液进行SDSPAGE分析。利用丙酮酸法检测重组蒜酶的活性。并采用DPPH·法,分别研究有氧及无氧条件下蒜酶催化蒜氨酸分解产生蒜素的抗氧化活性。从大蒜中克隆出蒜酶基因,重组酶存在于毕赤酵母表达上清液中,形成糖蛋白,酶的比活力为(115.81±1.93)U/mg;无氧条件下蒜酶催化蒜氨酸分解产生蒜素的抗氧化能力高于有氧条件。克隆了蒜酶编码基因,并成功实现在毕赤酵母中的有效表达。无氧条件下蒜酶催化蒜氨酸分解产生蒜素抗氧化能力比有氧条件下高,为体内利用蒜酶和蒜氨酸制备高抗氧化能力的制剂提供基础。     

杂合木聚糖酶的设计及在毕赤酵母中的表达

人工设计合成木聚糖酶,为木聚糖酶分子改造研究提供新思路。采用合成生物学思路,以黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2基因序列为基础,将N端48个氨基酸替换成Ev Xyn11 N端的34个氨基酸;引入芳香族氨基酸P9Y和H14F;在C端引入二硫键Cys38-Cys191;α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I、V111A以及G109A,设计杂合酶Xyn ZL。基因全合成后,构建毕赤酵母重组表达质粒p PIC9K-ZL,将其转化酵母菌GS115,对工程菌GS115-XynZL进行单因素发酵条件优化及重组酶酶学性质测定。最佳发酵培养基为土豆培养基,最佳诱导温度为28℃,最佳种龄为20 h,最佳诱导时间为168 h,最佳诱导起始pH值为6. 5,甲醇诱导最佳体积分数为15 mL/L。重组酶酶学性质显示:最佳反应温度为55℃,最适pH值为5. 0,杂合酶Xyn ZL在毕赤酵母中表达后具有特定性质和功能,其设计方法拓宽了木聚糖酶分子改造研究的思路。     

木聚糖酶基因XynB在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

目的:将来源于Thermotoga maritima的酸性耐高温木聚糖酶基因Xyn B通过密码子优化整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高效表达木聚糖酶Xyn B的毕赤酵母工程菌并研究其酶学性质。方法:通过分子克隆手段构建目的基因重组质粒以及二拷贝重组质粒,并将重组质粒导入毕赤酵母进行发酵表达,用DNS法测定发酵液酶活,并对酵母工程菌分泌的木聚糖酶进行一系列的酶学性质研究。结果:木聚糖酶的最适p H和温度分别为6.0和60℃;在p H4~6之间,稳定性较好,相对比酶活均在80%以上;在60℃和70℃保温2 h残留酶活分别为80%和70%左右;Co~(2+)对木聚糖酶活性有较明显的促进作用,Fe~(2+)、K~+和Zn~(2+)对酶的活性有微弱的促进作用,而Cu~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Na~+对木聚糖酶活性有不同程度的抑制作用。TLC检验该木聚糖酶可以将木聚糖水解为二糖和少量单糖。通过10 L发酵罐发酵,最大酶活达到了8000 U/m L。结论:木聚糖酶在毕赤酵母中实现了高效表达,并获得了木聚糖酶的最适反应条件等一系列酶学性质,该酶性质优良适合用于饲料添加剂。     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达

从高产糖化酶的黑曲霉的cDNA文库中筛选出糖化酶基因,并研究在毕赤酵母中的表达情况。运用RT-PCR从黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pPIC9K相连,构建重组载体,电转化毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆并进行研究。阳性克隆在MM培养基中发酵72 h和1%的甲醇的诱导的情况下,重组毕赤酵母产生的糖化酶酶活最大为15.6 U/mL。测定结果显示,其糖化酶大小为1 908 bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质。经柱分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得分子质量大约为80 ku。黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母GS115中成功得到了表达。     

黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析

基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。