我国水痘-带状疱疹病毒VZV84-7减毒株基因特征研究

目的　建立水痘 带状疱疹病毒 (VZV)毒株的特异性鉴定方法 ,研究我国分离的VZV84 7减毒株(VZV84 7株 )基因特征。方法　利用PCR分别扩增VZV84 7株和Oka株R2和R5可变区基因 ,比较两者串联重复单位拷贝数 ;用PCR结合限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)分析VZV84 7株和Oka株基因的BglI、PstI酶切位点突变 ;并对gpI编码区基因进行序列分析。结果　VZV84 7株R2、R5区PCR产物分别为 4 2 5bp和 2 5 5bp ,对应的串联重复单位拷贝数分别为 7和 1;Oka株R2、R5区PCR产物分别为 4 2 5bp和 36 7bp ,对应的串联重复单位拷贝数分别为 7和 2。VZV84 7株基因存在PstI酶切位点 ,而Oka株无PstI酶切位点 ;两者均存在BglI酶切位点。基因序列分析显示 ,VZV84 7株与Oka株在gpI区存在 4个碱基差异 ,并导致 1个编码氨基酸不同 ,氨基酸序列同源性为99 8%。结论　所建立的PCR和PCR RFLP方法简便、特异 ;VZV84 7株的基因特征与Oka株存在一定差异 ,但两株之间gpI编码区氨基酸序列具有较高的同源性     

水痘-带状疱疹病毒VZV84-7株全基因序列测定及分析

目的分析我国自行分离的水痘-带状疱疹病毒疫苗株北京株(VZV84-7株)的全基因序列及特征。方法采用超速离心法获得纯化病毒颗粒,酚-氯仿法抽提病毒基因组DNA后超声破碎,回收1500～3000bp的片段,克隆至质粒pUC18中,构建病毒DNA文库,进行测序及序列分析,并与Dumas野毒株进行比较,绘制种系发育树,分析其与其他株VZV的同源性。结果VZV84-7株基因组全长125083bp,G+C含量为46.1%。基因组各区段长度及G+C含量分别为:UL:104746bp,G+C:44.3%;TRL和IRL:各89bp,G+C:69.7%;Us:5235bp,G+C:42.8%;TRS和IRS:各7462bp,G+C:59.3%。其R2可变区重复单位的拷贝数为7个,R4可变区为9个,R5可变区为1个。VZV84-7株共有71个ORFs,其中3个基因位于重复序列区,位于IRS的ORF69～71与位于TRS的ORF62～64序列完全一致。与Dumas株相比,共有248个核苷酸位置存在差异,大部分突变为单个核苷酸替换,另有部分插入或缺失性突变。其中碱基转换比碱基颠换更常见,发生率分别为66%和34%。种系发育分析结果显示,VZV84-7株与其他株VZV的同源性为95%以上。结论VZV84-7株具有其独特的基因特征,但与其他株VZV具有较高的同源性。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株gC基因的克隆及序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株gC基因进行克隆及序列分析。方法取第40代Oka VZV疫苗株,反复冻融3次后,收集上清,提取病毒DNA,根据NCBI登录的Dumas株VZV序列,设计引物,扩增gC基因,与pMD19-T Vector连接后,热转化至E.coli Competent Cells JM109中,挑选阳性菌落进行测序;将得到的序列与Gen Bank中登录的其他12株VZV毒株的gC基因序列,进行核苷酸序列和氨基酸水平分析。结果 13株VZV-gC基因开放阅读框(ORF)的核苷酸长度为1 557~1 776 bp,编码的蛋白由519~592个氨基酸组成。核苷酸序列同源性在94.8%~100%之间,氨基酸序列同源性在93.9%~100%之间。R2重复拷贝数为7,Dumas、SVETA和Ellen重复拷贝数为6,LAX1为4。结论 VZV Oka株gC蛋白具有高度的保守性,与其功能的发挥密切相关。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性及基因序列差异位点分析

目的研究水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性,并对不同代次毒株进行全基因测序及差异位点分析。方法将VZV Oka株在SV-1细胞株上连续传至48代,检测病毒滴度。对VZV Oka株33、35、38、39及48代病毒进行全基因测序,应用DNASTAR.Lasergene.v 7.1软件进行数据的拼接及序列分析。结果 VZV Oka株在SV-1细胞上连续传代获得的33~48代病毒滴度在4.000~4.625 lg CCID50/ml之间,病毒滴度的算数平均值为4.292 lg CCID50/ml;VZV Oka株基因组全长125 114 bp,GC含量46%;33、35、38、39、48代病毒的核苷酸序列同源性为99.99%,这5代病毒与标准疫苗株V-Oka的核苷酸序列同源性为99.96%;VZV Oka株在MRC-5、SV-1细胞上制备的38代病毒全基因序列有1个差异位点;本研究中的各代次病毒基因序列高度同源,与Varivax和Varilrix疫苗株、野毒株Dumas及亲本株p-Oka相比,与疫苗株V-Oka的同源性最高。结论 VZV Oka株在SV-1细胞上的适应性及遗传稳定性均良好。     

水痘-带状疱疹病毒gE糖蛋白基因扩增法鉴别水痘减毒活疫苗

目的利用水痘-带状疱疹病毒(VZV)gE糖蛋白基因鉴别水痘减毒活疫苗。方法以提取的病毒DNA为模板,PCR扩增gE糖蛋白基因。经琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果水痘减毒活疫苗Oka株VZV(病毒滴度≥2.0lgPFU/ml)通过琼脂糖电泳均可见特异性的条带。使用同样的方法检测麻疹减毒活疫苗、麻疹-腮腺炎联合疫苗、风疹减毒活疫苗以及Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒(病毒滴度≥4.2lgCCID50/ml),结果均为阴性。结论gE糖蛋白基因可以作为VZV的特异性指标,进行病毒鉴别试验。     

2021—2022年长春市水痘-带状疱疹病毒流行株基因序列的特征分析

目的 对2021—2022年长春市水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)流行株进行基因型鉴定及分子特征分析。方法 选择59例2021—2022年吉林大学中日联谊医院收治的长春市水痘或带状疱疹患者为研究对象，采用膜抗原荧光抗体(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)法对患者血清中VZV特异性抗体进行鉴定。提取确诊患者疱疹液中的病毒DNA,PCR扩增VZV的多个开放阅读框(open reading frame,ORF)，包括ORF1、ORF12、ORF16、ORF17、ORF21、ORF22、ORF37和ORF54，根据ORF的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)进行基因分型。通过限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)技术对多个ORF(ORF38、ORF54和ORF62)进行酶切鉴定，区分VZV临床株及疫苗株。结果 59份患者血清样本均为阳性，均确诊为VZV感染。59份疱疹液样...     

水痘-带状疱疹病毒Oka株与临床分离株可变区基因的序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)Oka株(V-Oka株)与分离于临床水痘患者的野毒株进行可变区基因序列比对分析。方法提取V-Oka株和VZV临床分离株的基因组DNA,对其串联重复序列区(R区)进行PCR扩增和测序;将R3基因的纯化产物与pMD18-T载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,提取质粒,经双酶切鉴定及测序;将测序结果与GenBank中登录的V-Oka株基因序列进行比对分析。结果 R1～R5基因扩增产物及R3基因重组质粒的双酶切产物片段大小均与预期相符;V-Oka株较稳定,测序结果与GenBank中登录的V-Oka株R1～R5基因序列一致,野毒株R区序列呈现多态性,与V-Oka株有差异,R4区序列区别明显。结论水痘患者的致病毒株为野毒株;R4的重复单位拷贝数可为临床快速鉴别V-Oka株与野毒株提供科学的手段。     

BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株的连续传代及其基因稳定性

目的观察上海生物制品研究所有限责任公司BRD-Ⅱ风疹病毒株(S-BRD-Ⅱ株)在MRC-5细胞中连续传代的基因稳定性,并比较该毒株与其他上市风疹毒株E1基因的差异。方法将S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞中连续传10代,检测每代病毒的培养特性和E1基因序列,第28、29、33和38代病毒的ORF序列及第28、38代病毒的5′-和3′-末端序列,同时测定B-BRD-Ⅱ株(北京天坛)及进口疫苗风疹病毒株(RA 27/3)E1基因,并对各基因的核苷酸及其相应的氨基酸序列进行分析。结果 S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞上连续传10代,其培养特性、细胞病变(CPE)程度及病毒滴度基本稳定,S-BRD-Ⅱ株病毒E1基因未发生变异,与Gen Bank中登录的BRD-Ⅱ株比较,有一个特异性的沉默突变,与RA 27/3疫苗株病毒比较,有122个核苷酸位点及其相应6个氨基酸发生突变。第28、29、33、38代S-BRD-Ⅱ株病毒的ORFⅠ和ORFⅡ基因区域与Gen Bank登录的BRD-Ⅱ株病毒比较,有5个位点发生变异,且P150非结构蛋白编码区域基因出现大片缺失。第28和38代S-BRD-Ⅱ株病毒的5′-末端与Gen Bank中登录的BRD-Ⅱ株序列的5′-末端一致,而3′-末端有一个氨基酸发生突变。结论 BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株在MRC-5细胞中具有良好的传代稳定性,所有上市风疹病毒株的E1基因氨基酸序列差异不大。     

重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因

目的通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。     

口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3′NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段。方法以FMDV WFL株RNA为模板,用3′RACE法扩增出2C-P3-3′NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较。结果扩增的基因片段大小为4033bp,其2C、P3和3′NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87·11%～94·23%、84·91%～96·66%和66·98%～82·35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94·97%～99·39%和91·84%～98·55%,WFL株P3基因的第1150～1270、1680～1840和2080～2490bp以及2C基因的第354～470bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性。因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA。结论成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3′NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段。