高压脉冲电场结合糖基化对β-乳球蛋白抗原性与结构的影响

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)是一种营养丰富的牛乳清蛋白,但也是导致牛乳过敏的主要过敏原;本文以β-Lg为研究对象,通过酶联免疫吸附法、电泳、圆二色谱及荧光光谱等方法,在蛋白与糖的质量比为1:2、修饰温度60℃、反应时间3 h、反应环境p H 7.4和不同高压脉冲电场(pulsed electric fields,PEF)强度反应条件下,对β-Lg-半乳糖复合物中β-Lg的抗原性变化及反应产物的结构特性进行研究。结果表明:经过PEF结合糖基化处理后,β-Lg抗原性显著降低,且PEF预处理会促进β-Lg抗原性降低,在电场强度25 k V/cm下预处理90μs后进行糖基化,β-Lg抗原性降低最多,降低了约72.9%;其分子量增大;α-螺旋和β-转角结构减少,而β-折叠和无规则卷曲结构逐渐增多;表面疏水性和内源性荧光强度均降低;自由巯基含量先升高后下降,这为制备低致敏性β-Lg提供了一种新的方法。     

超声波处理对β-乳球蛋白结构和抗原性的影响

采用电泳、圆二色谱、荧光光谱及酶联免疫吸附等方法,研究了超声波处理对β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-Lg）结构和抗原性的影响。结果表明:随着超声波功率的增大,β-Lg的分子量无显著性变化,自由巯基含量下降,β-折叠含量和表面疏水性呈先升高后降低的趋势,且均在400 W时达到最大值。这表明超声波处理能迫使β-Lg结构展开,破坏其高级结构。与此同时,β-Lg的抗原性呈先升高后降低的趋势,在400 W 25 min时达到最大,为2540.20μg/m L,比未处理样品增加了133%,这表明β-Lg结构的展开可能会导致其过敏表位的暴露,因此,β-Lg抗原性的改变可能与其高级结构的变化有关。      

聚乙二醇修饰β-乳球蛋白羧基对其抗原性和结构的影响

采用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）对β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-LG）羧基共价修饰,探究PEG修饰及PEG化程度对β-LG抗原性和结构的影响。结果表明：总修饰率为82.91%;使用SP?Sepharose?Fast?Flow阳离子交换柱分离纯化,获得纯度分别为99.66%和98.61%的两种主要修饰产物;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定产物分子质量分别为23.3?kDa和28.6?kDa,为单修饰产物（mono-PEG-β-LG）及两点修饰产物（di-PEG-β-LG）。β-LG、mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的间接竞争酶联免疫吸附测定半抑制浓度（IC50）分别为1.90、2.47?μg/mL和10.41?μg/mL;mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的IC50分别是β-LG的1.30?倍和5.48?倍,表明提高PEG修饰程度可极显著降低β-LG的抗原性。mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的游离巯基含量分别为42.70?μmol/g和37.97?μmol/g,表明PEG化程度增强,遮蔽作用增强。表面疏水性和内源荧光分析表明,mono-PEG-β-LG只发生了三级结构变化,而di-PEG-β-LG二级结构水平同时发生变化,表明PEG修饰后β-LG空间结构的改变可能是导致其构象表位破坏和抗原性下降的因素。PEG分子遮蔽可能是导致修饰产物抗原性降低的另一原因。PEG共价修饰β-LG可以显著降低后者的抗原性,且随PEG化程度增大β-LG抗原性降低幅度增加。     

聚乙二醇修饰对牛乳β-乳球蛋白抗原性的影响

通过不同修饰反应物质的量比、修饰反应时间、pH值,用单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(SC-mPEG)对牛乳β-乳球蛋白(β-LG)进行修饰,研究其抗原性的变化。利用间接竞争ELISA检测结合产物的抗原性,结果显示不同条件下PEG修饰后的β-乳球蛋白的抗原性最高降低率,反应8h时为70.2%。三硝基苯磺酸(TNBS)法测定不同条件反应后样品修饰度,反应8h时最高修饰度为39.1%。结果表明修饰反应时间为SC-mPEG修饰β-LG后其抗原性降低的主要因素。     

食品中β-乳球蛋白过敏原检测方法的比较

目的 比较市场上销售的两种检测牛奶中β-乳球蛋白ELISA试剂盒效果。方法 以脱脂奶粉、β-乳球蛋白作阳性添加成分, 对两个品牌的ELISA试剂盒从回收率、精密度、特异性等方面进行比较。结果 ELISA试剂盒可以对多种食品进行β-乳球蛋白含量检测, 回收率、精密度等各项检测性能指标均可满足相关检测低限要求。结论 ELISA检测试剂盒无需大型分析仪器、操作简便快捷、适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控。     

高压脉冲电场结合糖基化对β-乳球蛋白过敏原性与功能性质的影响

采用高压脉冲电场(pulsed electric field,PEF)结合糖基化处理β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg),在β-Lg与半乳糖质量比1:2、反应温度60℃、反应时间3 h、p H 7.4和不同PEF强度反应条件下,研究改性前后β-Lg的过敏原性和功能性质的变化。结果表明,经过PEF结合糖基化处理后,β-Lg自由氨基含量显著降低,β-Lg过敏原性有一定程度下降,15 kV/cm PEF处理90μs后进行糖基化,过敏原性降低程度最大;在此条件下,β-Lg的溶解性、乳化性、乳化稳定性及抗氧化活性显著提高(P0.05)。这为制备低致敏性且功能性质好的β-Lg提供了一种新的方法。     

碱性蛋白酶对β-伴大豆球蛋白抗原性的影响

选用碱性蛋白酶处理大豆分离蛋白,间接竞争ELISA法测定水解物中β-伴大豆球蛋白的抗原性,响应面法优化降低β-伴大豆球蛋白抗原抑制率的最佳工艺条件。结果表明,碱性蛋白酶可以显著降低β-伴大豆球蛋白的抗原性,在一定程度上,水解度与β-伴大豆球蛋白抗原抑制率呈负相关关系。碱性蛋白酶在酶解时间40 min、加酶量3 000 U/g、温度55℃、p H 8.5条件下,β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为33.48%,比大豆蛋白降低了64.16%。SDSPAGE结果显示,β-伴大豆球蛋白基本被酶解成小分子量肽段。     

低聚异麦芽糖糖基化法降低牛乳β-乳球蛋白抗原性

利用凝胶过滤层析法从牛乳乳清分离蛋白中分离纯化β-乳球蛋白,然后利用美拉德反应制备β-乳球蛋白与低聚异麦芽糖结合产物.通过竞争和非竞争ELISA法检测该结合产物的抗原性,结果显示糖基化后的β-乳球蛋白的抗原性得到显著降低.利用双缩脲法和苯酚硫酸法测定该结合物的组成,结果显示该结合物中β-乳球蛋白和低聚异麦芽糖摩尔比为1∶8.进而对该结合物进行凝胶过滤层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果显示该结合物相对分子量为44kDa.仍保持原有二聚体结构.     

低聚异麦芽糖糖基化法降低牛乳β-乳球蛋白抗原性

利用凝胶过滤层析法从牛乳乳清分离蛋白中分离纯化β-乳球蛋白,然后利用美拉德反应制备β-乳球蛋白与低聚异麦芽糖结合产物。通过竞争和非竞争ELISA法检测该结合产物的抗原性,结果显示糖基化后的β-乳球蛋白的抗原性得到显著降低。利用双缩脲法和苯酚硫酸法测定该结合物的组成,结果显示该结合物中β-乳球蛋白和低聚异麦芽糖摩尔比为1:8。进而对该结合物进行凝胶过滤层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果显示该结合物相对分子量为44kDa,仍保持原有二聚体结构。      

牛奶过敏原β-乳球蛋白抗体的制备及免疫检测方法的建立

本文将牛奶过敏原β-乳球蛋白抗原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠制备其多克隆抗体和单克隆抗体,并对所获得的抗体进行了效价等特性测定;采用蛋白A亲和层析法将多克隆抗体进行了纯化,采用辛酸-硫酸铵法对单抗细胞株3A7进行了纯化;实验建立了双抗体夹心的ELISA检测方法,并对一些蛋白样品进行了初步的检测。实验结果表明,所制备的抗β-乳球蛋白兔多克隆抗体效价达到了1:6.56×106;Western-blotting鉴定结果显示所制备的多克隆抗体能够与β-乳球蛋白特异性反应;3株单抗的效价均在106以上,纯化后多抗仅与酪蛋白有一定的交叉反应,而纯化后单抗与乳中主要蛋白及其它过敏原蛋白基本没有交叉反应,特异性很好;利用所建立的方法对一些蛋白样品进行检测,准确率100%。     

聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白谷氨酰胺残基条件优化及其对蛋白抗原性的影响

采用谷氨酰胺转氨酶(TG酶)催化聚乙二醇(PEG)定点修饰技术对β-乳球蛋白(β-LG)的谷氨酰胺残基进行修饰,探究其对蛋白抗原性的影响。通过SDS-PAGE结合凝胶过滤色谱对修饰产物的修饰率进行分析,通过优化得最佳修饰条件为pH 7.0,温度25℃,β-LG与PEG摩尔比1:15,TG酶与β-LG质量比3:1,缓冲液中乙醇添加量25%(体积分数),该条件下修饰率为60.17%。采用阳离子交换色谱对修饰产物进行分离纯化,SDS-PAGE分析显示,纯化得到的修饰产物表观分子量在28kDa左右,为PEG单修饰产物。反相高效液相色谱分析结果表明,修饰产物均一,无其它位置异构体存在。间接竞争ELISA测定结果表明,经PEG修饰后β-LG的抗原性显著降低,降低率为59.04%。     

β-乳球蛋白聚乙二醇定点修饰物的制备及其抗原性变化

为探究不同共价修饰位点对β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)抗原性影响,采用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)定点修饰技术对β-LG第121位半胱氨酸(Cys121)游离巯基进行修饰.通过单因素试验优化,得到最佳修饰条件:β-LG与mPEG-MAL物质的量比1∶30,在0.1...     

动态高压微射流技术对β-乳球蛋白微观结构的影响

采用动态高压微射流技术（DHPM）处理β-乳球蛋白,研究DHPM对β-乳球蛋白微观结构的影响。实验结果表明,未处理的β-乳球蛋白的微观结构表现为球体且分布紧凑。随着DHPM处理压力的逐渐增大,β-乳球蛋白分子被逐渐打散,大部分颗粒逐渐变细。然而仅有小部分β-乳球蛋白分子在经过100MPa和150MPa处理后,发生了部分团聚现象,分别形成不同聚集体的形貌结构。     

反式肉桂酸对β-伴大豆球蛋白抗原性及结构的影响

为探究碱性条件（pH9.0）下反式肉桂酸（trans-cinnamic acid,TCA）对β-伴大豆球蛋白抗原性、抗原表位及蛋白结构的影响,利用间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法评估互作后蛋白与免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）及表位抗体的结合能力;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）测定蛋白分子量变化;利用紫外、荧光、红外光谱表征蛋白的结构变化。结果表明：在碱性条件下TCA与β-伴大豆球蛋白之间存在相互作用,且TCA可以降低蛋白的抗原性。互作后蛋白质的二、三级结构有显著变化,并降低了蛋白的表面疏水性,随着TCA添加浓度的增加,表面疏水性变化更加明显。     

分子动力学探究高压对β-乳球蛋白与多酚结合的影响

为探究不同压力下多酚与蛋白的结合规律,以表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)和 β-乳球蛋白为研究对象,采用分子对接和分子模拟研究两者结合能和结合机制在0.1、200、500、800 MPa时的变化.结果表明,EGCG常压下主要结合在疏水腔(1号区域),蛋白经200和5...     

动态高压微射流协同糖基化对β-乳球蛋白乳化性和结构的影响

采用动态高压微射流(dynamic high pressure microfluidization,DHPM)协同糖基化处理β-乳球蛋白,研究改性β-乳球蛋白乳化性、乳化稳定性和结构的变化。研究发现DHPM协同糖基化处理过程中β-乳球蛋白结构变化与其乳化性能可能存在关联;DHPM协同糖基化处理能显著提高β-乳球蛋白的乳化性和乳化稳定性。0、40、120 MPa糖基化处理后β-乳球蛋白的乳化活性指数(emulsifying activity index,EAI)分别为136.3、168.1、177.9 m2/g。0 MPa协同糖基化处理后β-乳球蛋白的乳化稳定指数(emulsifying stability index,ESI)为52.3 min;随着压强逐渐增加至40 MPa和120 MPa,协同糖基化处理后ESI值分别升高为56.4 min和59.0 min。通过表征分析β-乳球蛋白结构变化发现:不同压力DHPM协同糖基化处理后,β-乳球蛋白分子质量升高;巯基含量升高;表面疏水性降低;二级结构变化以及氨基酸三维空间构象暴露程度发生变化。这些变化说明β-乳球蛋白与低聚半乳糖发生共价交联时改变了蛋白质结构,造成β-乳球蛋白表面亲水基团的增加,从而导致其乳化性能显著提高。     

碱性氨基酸对β-乳球蛋白结构和致敏性的影响

碱性氨基酸是一种自身带正电荷的小分子,可与蛋白质上的负电残基发生静电吸引,也可与蛋白侧链上某些基团构成空间位阻,进而导致蛋白质结构的改变。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-Lg)可引发过敏反应,通过不同碱性氨基酸对β-Lg进行处理,研究其结构和致敏性的变化规律。以L-精氨酸(L-Arg)、L-赖氨酸(L-Lys)和L-组氨酸(L-His)单独或混合处理的β-Lg为研究对象,通过电泳、圆二色谱、光谱等技术分析其结构的变化;采用酶联免疫吸附法、细胞实验等方法评价其抗氧化活性、免疫球蛋白E(immune globulin E,IgE)/免疫球蛋白G(immune globulin G,IgG)结合能力和KU812细胞释放组胺和白介素-6的能力。结果表明,L-Arg、L-Lys和L-His处理β-Lg后,改变了β-Lg的二级结构、紫外吸收强度、内源荧光强度和表面疏水性,同时增加其ABTS阳离子自由基清除能力、降低IgE/IgG结合能力以及KU812细胞中组胺和白细胞介素-6的分泌能力。因此,L-Arg、L-Lys和L-His破坏β-Lg的构象过敏表位,降低其致敏性,顺序依次为...     

牛奶主要过敏原β-乳球蛋白的一基因片段的克隆、表达、纯化及抗原性鉴定

目的 克隆并表达牛奶中主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的一基因片段,并检测其杭原性.方法 利用RT-PCR技术克隆β-LG蛋白基因片段,测序后将目的片段克隆入原核表达质粗pET载体,转化至大肠杆菌origami,经IPTG诱导表达,获得重组β-LG片段蛋白.用Nit~2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELLSA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性.结果 克隆获得β-LG片段蛋白,其开放阅读框基因为264 by(含终止密码子),编码87个氨基酸.获得的重组β-LG片段蛋白既以包涵体形式存在又以可溶性形式存在,用可溶性的蛋白进行纯化,经Western blot和ELISA检测具有较好的抗原性.结论 成功地克隆和表达了β-LG的--基因片段,为后续牛奶的免疫原性研究提供参考,也为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体和制备其主要过敏原的检测试剂奠定了基础.     

糖基化对β-乳球蛋白结构的影响

目的:考察还原糖以及活性二羰基化合物诱导的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)发生糖基化后结构的变化。方法:运用气相色谱法检测β-乳球蛋白+乳糖糖基化反应体系中二羰基化合物的产生,并通过紫外-可见分光光度法、圆二色谱法、体积排阻色谱法定性分析不同活性羰基引发糖基化反应对β-lg结构的改变。结果:β-乳球蛋白+乳糖糖基化反应体系可以迅速产生二羰基化合物,在125℃条件下,30 min后,丙酮醛和乙二醛含量高达207μg/g和180μg/g,而后逐渐减少并趋于稳定(150μg/g)。光谱学实验结果表明,还原糖以及活性二羰基化合物可以有效地诱导β-lg结构从β-折叠转变为α-螺旋;通过体积排阻色谱实验,β-lg加热糖基化后在120~190 min有新的产物色谱峰产生。结论:还原糖和活性二羰基化合物能有效地诱导β-lg糖基化反应,引起其蛋白二级结构的改变。     

活性氧对牛乳β- 乳球蛋白结构、功能特性和致敏性的影响

为分析牛乳加工过程中活性氧氧化对牛乳β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-LG）结构、功能特性和致敏性的影响,以牛乳β-LG 为研究对象,利用圆二色谱、表面疏水性和内源荧光光谱分析活性氧氧化前后β-LG 结构的变化,同时测定其功能特性的变化,通过酶联免疫试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和大鼠嗜碱性细胞白血病细胞（rat basophilic leukemia cells,RBL-2H3）评价其致敏性的变化。结果表明：活性氧氧化后,β-LG 的α-螺旋含量降低,二级结构更无序,表面疏水性升高,内源荧光强度降低,起泡能力和起泡稳定性增加,乳化活性降低,但乳化稳定性升高。β-LG 的免疫球蛋白E 结合能力和RBL-2H3 中β-已糖苷酶释放率和组胺的释放量降低。表明加工过程中适当氧化可以改变牛乳β-LG 构象结构,从而显著改善功能特性与降低潜在致敏性。该研究为探究食品加工过程中牛乳蛋白功能特性及其致敏性的变化规律提供参考。