幽门螺杆菌在BALB/c小鼠中的定植及初步评价

目的建立长期、稳定定植于小鼠胃部的幽门螺杆菌动物模型,并进行免疫反应检测分析。方法用灌胃针灌喂小鼠幽门螺杆菌3次后,定期处死并进行胃组织幽门螺杆菌培养试验、PCR鉴定、组织切片染色、快速尿素酶试验、胃组织病理学检查、血清抗幽门螺杆菌抗体检测及细胞免疫分析。结果 6周龄小鼠观察至32周,3周龄小鼠观察至12周时,幽门螺杆菌定植量均稳定在约104个CFU/g胃组织;诱导产生的血清抗幽门螺杆菌IgG抗体水平均在10周时到达峰值,并一直维持较高水平;粪便中均未检测到特异性sIgA抗体;3周龄小鼠感染幽门螺杆菌2周时的流式细胞术检测结果显示,肠道上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes,IELs)IL-17和IFNγ反应较未感染对照组小鼠均有降低趋势;胃组织切片染色分析显示,定植小鼠从感染后第6周胃部开始出现病理变化。结论获得了幽门螺杆菌在BALB/c小鼠中的长期稳定定植模型,观察到组织病理变化和显著的血清IgG抗体反应,粪便中未观察到特异性sIgA反应,3周龄小鼠观察到Th1及Th17反应有降低趋势,为治疗性疫苗候选抗原的评价奠定了基础。     

人源细胞间黏附分子-1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

目的建立并验证细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测不同细胞中ICAM-1的基因水平。方法根据GenBank中登录的ICAM-1基因序列设计并合成引物,建立ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法,验证方法的适用性、线性范围、灵敏性、特异性及精密性。同时采用该方法对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、人星形神经胶质瘤细胞(u251)、人原发性肝癌细胞(PLC/PRF/5)、人胚肾细胞(HEK293)及人脐静脉内皮细胞(HuvEc)进行检测。结果该方法的溶解曲线峰单一,无非特异性产物和引物二聚体;标准质粒在6. 74×10~4～6. 74×10~9 copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好的线性关系,线性方程为y=-3. 576 log x+42. 982,R~2=1. 000;建立方法的灵敏性是普通PCR法的10倍;该方法检测不同物种细胞无交叉反应,仅能检出人源细胞ICAM-1;批内和批间CV均1%。不同组织来源的细胞内ICAM-1基因含量不同,其中MRC-5细胞含量最高。结论成功建立了ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,且具有良好的特异性、灵敏性及精密性,可用于ICAM-1基因的定量检测。     

细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行优化及初步验证。方法以MS2噬菌体RNA模板及相应引物,建立一步检测逆转录酶扩增产物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,以梯度稀释的重组莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,MMLV)逆转录酶活性参考品绘制标准曲线,进行逆转录酶活性的定量。对反应的引物和2×RT-PCR Mix进行优化,并对建立的方法进行线性关系、灵敏度、精密度和准确度验证。结果 1组引物(上游:5′-CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG-3′,下游:5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3′)更适合本方法;Promega公司生产的2×RT-PCR Mix具有更高的反应效率。逆转录酶活性在5.40×108~5.40×104pU/μl范围内定量标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.999 7;该方法判断样品阴阳性的标准cut-off值为1.31×104 pU/μl;检测CHO-1细胞株样品逆转录酶活性的试验内变异系数(CV)为0.80%,试验间CV值为16.4%;检测5株细胞样品逆转录酶活性的平均加标回收率为122.8%。结论建立了生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,该方法能够准确地定量检测细胞株的逆转录酶活性。     

TaqMan MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA方法的适用性验证及应用

目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高(10-2 ng/μl)、中(10-4 ng/μl)、低(10-6 ng/μl)浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数(CV)为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。     

H5N1禽流感病毒感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并检测H5N1 AIV感染前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。方法提取豚鼠肺脏组织RNA,反转录合成cDNA,将cDNA模板按10倍系列稀释为9个浓度(1.00 E+10~1.00 E+02 copies/μl),进行PCR扩增。以β-actin为内参,建立标准曲线,比较两基因的扩增效率,验证该方法的引物特异性、重复性及灵敏度。同时用该方法检测H5N1 AIV攻毒前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。结果 c DNA模板最佳稀释度范围为1.00 E+09~1.00 E+04。豚鼠MAVS和β-actin基因的标准曲线斜率差值0.1,R~2=0.999,扩增效率分别为100.2%和100.3%;两基因扩增溶解曲线峰单一,可扩增出清晰的目的条带,且无非特异性扩增;两基因Ct值的变异系数(CV)均10%;灵敏度为1.00 E+03 copies/μl。感染H5N1 AIV的豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平下调。结论成功建立了H5N1 AIV感染豚鼠体内MAVS的SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并发现H5N1 AIV感染可导致豚鼠体内MAVS表达水平下调。     

幽门螺杆菌多亚单位融合蛋白疫苗的构建及免疫特性

目的构建幽门螺杆菌HspA、HpaA、UreB多亚单位融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性及免疫保护性。方法用PCR从Hp基因组中分别扩增HspA、HpaA、UreB3个基因片段,重叠延伸PCR将其构建成融合基因hhu,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切、测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,AKATA纯化仪纯化。纯化后蛋白口服免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体,末次免疫后进行攻毒试验,检测其免疫保护性。结果酶切及测序证实已成功构建HspA、HpaA、UreB融合基因的表达载体phhu,SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的表达,表达率为26·8%,纯化的融合蛋白纯度大于90%,口服免疫小鼠可产生特异性抗体,保护率达89·6%。结论所获得的融合蛋白保持了亚组分蛋白各自的免疫原性和免疫保护性,为幽门螺杆菌多亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌鞭毛蛋白B亚单位原核表达系统的构建及其产物的免疫性

目的　构建幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)鞭毛蛋白B亚单位 (flaB)原核表达系统 ,并鉴定其表达产物的免疫性。方法　采用PCR从幽门螺杆菌基因组DNA中扩增全长flaB基因 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET32a flaB表达载体 ,以E .coliBL2 1DE3为表达宿主菌 ,用SDS PAGE检测重组蛋白 (rFlaB)的表达水平。采用Hp全菌抗体的Westernblot和兔抗rFlaB血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和抗原性。结果　所克隆的flaB基因与文献报道的核苷酸序列同源性为 96 .31%～ 97.73% ,氨基酸序列同源性高达 99.4 1%～ 10 0 %。构建的原核表达系统pET32a flaB E .coliBL2 1DE3的rFlaB产量为细菌总蛋白的 4 0 %左右。Hp全菌抗体能识别rFlaB。rFlaB免疫家兔能获得高效价血清抗体。结论　已成功地构建了HpflaB高效原核表达系统 ,所表达的rFlaB有良好的免疫反应性和抗原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原     

幽门螺杆菌长期感染小鼠腺胃模型的建立

取Ⅱ级C57BL／6小鼠及Ⅲ级BALB／c小鼠各40只,随机分为两组。实验组接种Hp（SydneyStrain1,SS1）菌液0．4ml／只（约109／ml）,连续5次,1周完成,而对照组则不作相应处理。距最后一次接种4、8、12及24周（BALB/c16周）分别处死两组动物各5只。取胃粘膜组织分别进行尿素酶试验、Hp培养、改良Gimesa染色和HE染色来评价SS1在不同品系动物的定植及病理组织学改变。结果4周时所有实验组动物胃窦、胃体Hp检查均阳性,SS1主要定植于胃窦的胃小凹及腺腔,胃体较少;定植量随感染时间的延长有增加的趋势,至24周时仍有明显定植;C57BL／6小鼠定植量高于BALB／c小鼠,对照组动物未有Hp定植。病理组织学检查,在4周时各组动物均未见炎症反应,从第8周至24周（BALB／c16周）两品系小鼠的胃窦及胃体均出现轻至中度慢性活动性胃炎改变,但C57BL6／小鼠的炎症细胞浸润较BALB／c小鼠重。在本实验周期未见有萎缩性炎症改变,对照组动物未见有炎症反应。说明SS1Hp可长期定植于BALB／c及C57BL／6小鼠腺胃,引起慢性活动性胃炎改变。     

TaqMan实时定量RT-PCR检测轮状病毒G4型

目的应用基于TaqMan探针的实时定量RT-PCR检测轮状病毒(Rotavirus,RV)G4型VP7基因。方法从G1、G2、G3和G4型轮状病毒Vero细胞培养物中提取病毒总RNA,分别进行RT-PCR和实时定量RT-PCR,检测引物及探针的特异性;构建含轮状病毒G4型VP7基因的质粒,制备RNA参考品,绘制实时定量RT-PCR标准曲线;验证实时定量RT-PCR的灵敏度和精密性;对5个轮状病毒G4型培养物及G1、G2和G3型各3个病毒培养物进行检测,分析其实际应用性。结果以轮状病毒G4型VP7基因引物和探针只能从G4型轮状病毒总RNA中扩增出目的基因或检测到荧光信号的扩增,未在G1、G2、G3型轮状病毒总RNA中扩增出目的基因或检测到荧光信号的扩增;在2.34×107～2.34×103拷贝/μl范围内,反应扩增效率大于90%,R2大于0.98;该方法可检出100数量级的RNA样品,且试验内及试验间变异系数分别小于2.5%和4%;用建立的实时定量RT-PCR只检出5个轮状病毒G4型样品,而G1、G2、G3型样品均未检出。结论 TaqMan实时定量RT-PCR是一种灵敏度较高、特异性和精密性良好的定量检测轮状病毒G4型的方法。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶基因克隆及表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)过氧化氢酶(katA)基因并在大肠杆菌中进行表达。方法 采用PCR扩增幽门螺杆菌katA全长基因,将其克隆入pET-11c载体中,经测序证实后,在大肠杆菌中进行表达,产物用Western blot检测其抗原性并进行N末端氨基酸的测序。结果 幽门螺杆菌katA基因全长1 518bp,编码氨基酸505个。在BL21(DE3)中的表达量约占细菌总蛋白的24.9％,表达产物经SDS-PAGE显示其相对分子质量与软件预测结果 58 000相符,N末端5个氨基酸测序结果与Hp中天然的katA完全一致,经Western blot检测可被 Hp全菌抗血清识别。结论 katA能在大肠杆菌中进行高效表达,具有良好的免疫反应性,可望为研究 Hp的致病机理、实验诊断及亚单位疫苗等提供充足的katA原材料。     

实时定量PCR检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变及其与临床指标的相关性

目的采用实时定量PCR检测接受与未接受拉米夫定治疗的乙肝患者血清中乙肝病毒(HBV)突变情况,并将检测结果与临床指标进行相关性分析。方法采用touch-down PCR反应程序,并结合SYBR Green Ⅰ染料进行实时定量PCR,检测115份乙肝患者血清标本(其中50名患者未服用过拉米夫定,65名患者服用过拉米夫定)。随机选择115份标本中的30份用同样的方法提取血清DNA,进行PCR扩增及测序,并与实时定量PCR检测结果进行比较。将乙肝病毒YMDD突变实时定量PCR检测结果与临床各指标之间进行相关性分析。结果115份血清标本中,75份含有野生型HBV(其中49份来自未接受过拉米夫定治疗的患者),40份含有YMDD突变的HBV(其中1份来自未接受过拉米夫定治疗的患者);180位点的突变检测中,98份标本含有野生型HBV,17份标本含有突变型HBV。随机选取的30份标本测序结果与实时定量PCR检测结果完全一致。乙肝病毒拉米夫定耐药突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间无相关性,而乙肝病毒YMDD变异与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性,用药时间越长,发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后,180和204位点突变具有相关性。结论实时定量PCR可以高效、准确地检测拉米夫定治疗后乙肝病毒的耐药突变。     

Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒菌重组疫苗的制备和生物效应研究

目的研制表达幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗,并观察其生物学效应。方法以幽门螺杆菌标准株——悉尼株(SS1)的基因组DNA为模板,构建Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB。经口服免疫BALB/c小鼠后,检测肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体,同时观察小鼠体重、胃黏膜炎症程度等一般情况。结果构建Hp-UreB的SL3261/pTC01-UreB菌株,连续传80代可稳定表达Hp-UreB,菌落提取质粒后酶切及PCR鉴定均与pTC01-UreB符合;SDS-PAGE和Western blot显示pTC01-UreB转化SL3261可表达与Hp-UreB亚单位相符的相对分子质量约61000蛋白,该蛋白能与抗Hp兔血清反应;SL3261/pTC01-UreB口服免疫BALB/c小鼠的肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体明显增高,而小鼠体重和胃粘膜炎症指数与对照组差异无显著意义。结论Hp-UreB的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB口服免疫小鼠可诱导特异性免疫应答。     

人干扰素诱导跨膜蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立人干扰素诱导跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,IFITM)1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank中登录的人IFITM1、2、3及β-actin基因序列,分别设计4对特异性引物,以质粒pVAX1-IFITM1、2、3和pMD18-T-β-actin为模板,分别进行PCR及实时荧光定量PCR扩增,优化实时荧光定量PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线及扩增曲线,建立实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的重复性、灵敏度及特异性。结果各质粒的PCR及实时荧光定量PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见大小与理论值相符的特异性条带。IFITM1、2、3和β-actin的最佳荧光定量PCR引物浓度分别为0.2、0.5、0.4和0.5μl,最佳退火温度为55℃。各质粒标准曲线的循环数与起始模板拷贝数的相关性均较好(R2分别为0.998、0.990、0.990和0.995),扩增效率分别为106.284%、101.030%、104.929%和101.962%。IFITM1、2、3基因不同拷贝数的试验内CV为0.14%-0.72%,试验间CV为0.77%-1.58%;灵敏度分别为2.52×100、1.3×100和3.7×101copies;该方法未扩增出鸡肝脏及禽流感病毒H3N2 cDNA,可特异性扩增B型流感病毒cDNA,各标准质粒的溶解曲线约在同一温度出现1个单峰。结论已成功建立了IFITM1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法具有较高的重复性、灵敏度及特异性,为进一步研究IFITM1、2、3的功能及其基因表达与肿瘤发生发展的相关性奠定了基础。     

基于中和表位的GⅡ.4型重组诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒抗原含量检测方法的建立及验证

目的建立基于中和表位的GⅡ. 4型重组诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗原含量检测方法,并进行验证,以用于重组NoV疫苗质量控制。方法应用ELISA和HBGA-VLP阻断试验筛选中和性单克隆抗体,并筛选配对抗体,分别作为包被抗体和检测抗体,建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。确定方法的线性检测范围,并对方法的专属性、准确性和精密性进行验证。结果27株GⅡ. 4 VLP特异性ELISA检测阳性的杂交瘤细胞克隆中,有12株GⅡ. 4型阻断抗体检测呈阳性,选择具有GⅡ. 4型阻断活性的特异性单抗2H7-C5和2E6-B3作为双抗夹心抗体对,用于建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。该方法的线性测定范围为15. 63～250 ng/mL,标准曲线R2均 0. 98;准确性验证的加标回收率在72. 23%～134. 03%之间;重复性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为7. 06%,中间精密性验证的RSD分别为8. 04%和9. 14%。结论建立了基于中和表位的GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP抗原含量检测方法,该方法专属性、准确性、精密性良好,可用于GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP定量检测,为GⅡ. 4抗原相关疫苗研发中质量控制和检定提供了技术支持。     

猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证。用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果。结果优化后的荧光定量PCR反应体系:Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15μl;反应条件:95℃3 min,95℃10 s和60℃10 s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好(R2=0.999),扩增效率为102.5%。该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%².81%,试验间CV为1.23%2.81%,试验间CV为1.23%².21%,均<5%,最低检测限为102copies/μl。辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果最好,可使样品中的PPV滴度下降4 Logs。结论已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础。     

人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因穿梭质粒的构建及表达

目的构建人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中进行表达。方法PCR扩增幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI编码基因全长片段,克隆入pET32a(+)质粒,鉴定正确后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pJHSP70,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70-UreI,转化耻垢分枝杆菌,诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出585bp的UreI基因片段。重组质粒pJHSP70-UreI经酶切和PCR鉴定,与预期结果一致。目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的18.5%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中获得表达。     

医药

▲江苏盐城市尚庄粮油加工厂与腾达化工有限公司研制成功硫甲基-L-半胱氨酸,填补国内空白,可作为治疗爱滋病药物载体的原料。 ▲广州明兴制药厂独家生产治疗慢性肝类的新药苦参碱注射液。 ▲武汉海特医药公司出品抗乙肝转移因子。 ▲江苏省中医院研制成功胃幽门螺杆菌Hp检测盒和采样胶囊,通过临床试验后推广应用。     

浅谈在治疗胃、十二指肠疾病中根除幽门螺杆菌的重要性

自1983年幽门螺杆茵(Hp)培养成功后,幽门螺杆茵与慢性胃炎及溃疡病的关系普遍得到世界医务工作者的广泛重视.凼门螺杆茸阳性的慢性胃炎约占慢性胃炎的60%,以上,70%,的胃溃疡和90%的十二指肠清疡病人胃粘膜活检可发现此茵.目前已公认该茵是慢性胃炎的一个主要致病的原因.探讨幽门螺杆菌的致病机制及根除凼门螺杆菌的治疗方案是胃.十二指肠炎症及溃疡治疗的关键环节.     

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB融合蛋白的表达及生物活性研究

目的 通过基因工程方法构建并表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)以基因形式的融合蛋白,并对其生物活性进行初步研究,为幽门螺杆菌疫苗的研究奠定基础。方法 用PCR方法从本室构建的融合基因克隆载体扩增出融合基因2 040bp的片段,将融合基因插入原核表达载体pET-11-c中。结果 经全自动测序仪测序,SDS-PAGE和免疫印迹以及N端氨基酸测序分析,证实融合蛋白已在BL21中表达,初步纯化后通过动物实验和酶联免疫吸附试验证实其相应的免疫原性和免疫反应性,以及其中LTB成分和GM1结合的特性。结论 融合蛋白表达方式为幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗的研究奠定了基础。