重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及其免疫特性分析

目的利用重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,并分析该蛋白的免疫特性。方法将PCV2 Cap基因克隆至转移载体pFastBacⅠ,转化感受态E.coli DH10Bac细胞,获得重组杆粒r Bacmid-Cap,转染Sf9细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测重组杆状病毒,并于High Five(H5)细胞中进行高效表达。将小鼠随机分为PBS对照组、杆状病毒组、重组杆状病毒组及疫苗对照组,均经小鼠肌内注射,100μL/只,分别于第0和14天进行免疫,于首免后第21、28、35及42天经小鼠眼眶静脉丛采血,分离血清,ELISA法进行检测。结果 PCR和测序分析结果表明,重组转移质粒和重组杆粒构建正确。重组PCV2 Cap蛋白的相对分子质量约28 000,可与抗His标签单克隆抗体及抗PCV2 Cap多克隆抗体发生特异性结合。重组杆状病毒按MOI=5及1感染H5细胞约72 h,PCV2 Cap蛋白表达量最高,表达产量约150μg/mL。首免后第21、28、35及42天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于PBS对照组及杆状病毒组(P 0. 001);首免后第21、28、35天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于疫苗对照组(P 0. 05),首免后第42天,两组差异无统计学意义(P 0. 05)。结论成功利用杆状病毒表达系统高效表达了PCV2 Cap,重组蛋白可诱导小鼠产生较高水平抗体,本研究为PCV疫苗的研制奠定了基础。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆猪血清白蛋白(PSA)基因,并在毕赤酵母中分泌表达。方法Trizol法提取新鲜猪肝组织总RNA,经RT-PCR扩增PSA全长cDNA,克隆至酵母分泌型表达载体pPICZaC,构建重组表达质粒pPICZaC-PSA,电转化至毕赤酵母X33,甲醇诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒pPICZaC-PSA经双酶切及测序鉴定正确,表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约69500处可见特异条带,表达量为菌体总蛋白的29.5%,紫外吸收法测定蛋白含量为0.06mg/ml,并可与PSA多抗发生特异性反应。结论已成功克隆了PSA基因,并在毕赤酵母中获得表达。     

猪圆环病毒2b亚型Cap融合蛋白的原核表达及其免疫原性分析

目的原核表达猪圆环病毒2b亚型(porcine circovirus subtype 2b,PCV2b)Cap融合蛋白,并分析其免疫原性。方法以PCV2毒株(CAU0673)基因组为参考序列,His-Sumo-PCV2b-Cap-pUC57重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的片段;将其产物克隆至pMAL-C4x载体中,构建pC4x-PCV2b-Cap重组质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行直链淀粉树脂纯化。SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性,Western blot检测其反应原性;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,Western blot检测小鼠血清抗体特异性。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pC4x-PCV2b-Cap构建正确;融合蛋白MBP-Cap(matlose binding protein Cap)最适诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,其以可溶性形式存在,相对分子质量约为81000,与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBPtag多克隆抗体及免疫小鼠抗血清均可发生特异性反应。结论成功构建了pC4x-PCV2b-Cap重组表达载体,获得了可溶性的MBP-Cap蛋白,其纯化蛋白具有较好的免疫原性。本文为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。     

猪2型圆环病毒疫苗的研究进展

猪2型圆环病毒是引起猪圆环病毒病,如断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸疾病综合征、猪皮肤和肾病综合征等的重要病原体。该病毒可诱发多种病毒和/或细菌的混合感染和继发感染,给养猪业造成巨大的经济损失。近年来,国内外研究者都在致力于猪2型圆环病毒疫苗的研究开发。到目前为止,部分疫苗已在临床试验中取得成功,有的已投入应用,其他候选疫苗也正在积极研究过程中。本文就近年来国内外各类猪2型圆环病毒疫苗的研究进展及存在的问题和可能的解决办法作一综述。     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子,人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hPTH)基因,将其克隆于M13载体中,DNA测序验证正确。通过PCR从含有hPTH基因的M13载体获得了该基因,将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中,构建了重组质粒pPIC9K-hPTH,电击法转化甲醇毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9 3kDa处有明显的诱导蛋白带,与报道的hPTH的相对分子质量相近;酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hPTH免疫活性为132ng/L。     

HIV-1 Vpu蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的在毕赤酵母中表达并纯化人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)辅助调节蛋白Vpu。方法从质粒p CDNA3.1-vphu中PCR扩增vphu基因,插入毕赤酵母表达载体p PICZαA,构建重组表达质粒p PICZαA-vphu,转化巴斯德毕赤酵母野生型X33菌株,经甲醇诱导表达带有6×His标签的重组Vpu蛋白。表达产物经Ni-Agarose 6×His标签纯化柱纯化。表达和纯化产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-vphu经双酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约16 000,主要存在于细胞内;纯化后杂蛋白减少,与抗VPU抗体和抗His标签抗体均可结合,浓度为224μg/ml。结论利用毕赤酵母表达系统成功表达并纯化了HIV-1 Vpu蛋白,纯化的蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究其结构和功能以及靶点药物筛选模型的建立奠定了基础。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

N-末端核定位序列对猪圆环病毒衣壳蛋白病毒样颗粒在汉逊酵母中组装的影响

目的探讨N-末端核定位序列(nuclear localization signal,NLS)对猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)衣壳蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)中组装的影响。方法分别构建表达PCV2 ORF2全长及NLS截短型重组表达质粒p MOXZ-full和p MOXZ-ΔN40,电转至HP,构建重组酵母表达菌株full-HP和ΔN40-HP,获得的两种表达产物经蔗糖密度梯度超速离心及超滤后,Western blot法检测两种表达产物的单体蛋白表达和VLP组装效率,透射电子显微镜观察VLP形态,小鼠免疫试验检测VLP的免疫原性,地高辛标记DNA杂交法检测VLP的DNA结合能力。结果与全长ORF2表达产物PCV2-VLP(full)比较,NLS截短型表达产物PCV2-VLP(ΔN40)的单体表达量略有提高,但VLP组装效率及DNA结合能力均降低。两种VLP颗粒形态相近,直径约20 nm;两种VLP免疫小鼠血清的抗体几何平均滴度(GMT)差异无统计学意义(P0.05)。结论去除NLS可提高PCV2衣壳蛋白VLP单体的表达水平,但不是VLP组装所必须的,且可使VLP的组装率略有降低。本研究为PCV2-VLP结构和疫苗的研究奠定了基础。     

人巨细胞病毒pp65基因在毕赤酵母中的表达

目的构建表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌。方法扩增HCMVpp65336-507基因,构建重组表达质粒pPIC9/pp65336-507,转化毕赤酵母菌GS115。PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达产物。结果已构建和筛选到阳性表达克隆株,表达的pp65336-507蛋白的相对分子质量约为26000,能与特异的pp65抗体结合。结论已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。     

人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的高效表达

去除自行构建的质粒pPIC9K-07ALDH2的信号肽(α-Factor)得到质粒pPIC9K-ALDH2-delsign,采用电转化方法将该质粒转化到Pichia pastorisSMD1168中构建得到能在胞内高效表达人乙醛脱氢酶2(ALDH2)的基因工程菌株Pichia pastorisSMD1168(pPIC9K-ALDH2-delsign)。利用该重组毕赤酵母摇瓶发酵得到的发酵液的人ALDH2的酶活为0.315 U.mL-1,明显高于胞外表达时人ALDH2的酶活;经过亲和色谱分离纯化后的人ALDH2酶液的酶活为0.944 U.mL-1。     

人脑钠肽与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达重组人脑钠肽(BNP)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,并检测其活性。方法重叠PCR法拼接BNP二联体与HSA基因,插入表达载体pPIC9K,电穿孔法转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及活性检测。结果融合基因(BNP)2-HSA经测序正确,重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确。诱导72h,融合蛋白表达量最高,可达200mg/ml,且具有良好的反应原性,其活性为rhBNP标准品的1%。结论已在毕赤酵母中成功表达了具有一定生物活性的(BNP)2-HSA融合蛋白,为开发BNP长效药物奠定了基础。     

A simple unstructured model-based control for efficient expression of recombinant porcine insulin precursor by Pichia pastoris

Based on the fact that Pichia cell growth follows a Monod equation under the condition of methanol concentration limitation, a kinetics model of recombinant methylotrophic yeast Pichia pastoris expressing porcine insulin precursor (PIP) was developed in the quasi-steady state in the induction phase. The model revealed that the relationship between specific growth rate (μ) and substrate methanol concentration was in accord with the Monod equation. The fermentation kinetic parameters maximum specific growth rate (μ _max ), saturation constant (K _s ) and maintenance coefficient (M) were estimated to be 0.101 h⁻¹, 0.252 g l ⁻¹, and 0.011 g MeOH g⁻¹ DCW h⁻¹, respectively. The unstructured model was validated in methanol induction phase with different initial cell densities. Results showed that the maximum specific protein production rate (q _p.max ) of 0.098 mg g⁻¹ DCW h⁻¹ was achieved when μ was kept at 0.016 h⁻¹, and the maximum yield of PIP reached 0.97 g l ⁻¹, which was 1.5-fold as that of the control. Therefore, the simple Monod model proposed has proven to be a robust control system for recombinant porcine insulin precursor production by P. pastoris on pilot scale, which would be further applied on production scale. This work was presented at 13 ^th YABEC symposium held at Seoul, Korea, October 20–22, 2007.     

人松弛素H2类似物在毕赤酵母中的高效表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统高效分泌表达人松弛素H2类似物(Human relaxin-2 analogue,HR2),并检测其生物活性。方法通过密码子优化合成HR2基因,构建重组表达质粒pPICZαA-HR2,转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。表达产物经超滤和柱层析纯化后,切除人工C肽,检测其生物活性。结果经双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pPICZαA-HR2构建正确;Tricine-SDS-PAGE分析显示,表达的重组蛋白相对分子质量约6 500,表达量占菌体总蛋白的47.6%,为451μg/ml,且为分泌表达;Western blot分析显示,重组蛋白具有良好的反应原性;纯化的重组蛋白纯度达96%;经检测C肽切除的重组HR2对THP-1细胞具有刺激活性。结论成功在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了重组松弛素H2类似物,并具有一定的生物活性。     

Functional expression of horseradish peroxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris

The ability to engineer proteins by directed evolution requiresfunctional expression of the target polypeptide in a recombinanthost suitable for construction and screening libraries of enzymevariants. Bacteria and yeast are preferred, but eukaryotic proteinsoften fail to express in active form in these cells. We haveattempted to resolve this problem by identifying mutations inthe target gene that facilitate its functional expression ina given recombinant host. Here we examined expression of HRPin Saccharomyces cerevisiae. Through three rounds of directedevolution by random point mutagenesis and screening, we obtaineda 40-fold increase in total HRP activity in the S.cerevisiaeculture supernatant compared with wild-type, as measured onABTS [2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)](260 units/l/OD₆₀₀). Genes from wild-type and two high-activityclones were expressed in Pichia pastoris, where the total ABTSactivity reached 600 units/l/OD₆₀₀ in shake flasks. The mutantsshow up to 5.4-fold higher specific activity towards ABTS and2.3-fold higher specific activity towards guaiacol.     

人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的利用酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白。方法利用基因工程方法构建含人LIGHT胞外段基因和人Ig G4 Fc基因的重组质粒p PIC9K-LIGHT-Fc,经SalⅠ线性化后电转化感受态酵母菌GS115,PCR鉴定重组转化子。将阳性重组转化子经甲醇诱导表达后,RT-PCR法检测目的基因的转录水平,SDS-PAGE及Western blot法进行表达产物的鉴定。结果表达质粒p PIC9K-LIGHT-Fc经酶切及测序鉴定,证明构建正确。10个重组子均为Mut+型阳性转化子,经甲醇诱导后可扩增出特异性目的基因片段。表达的重组LIGHT-Fc融合蛋白相对分子质量约45 000,可与鼠抗人LIGHT多克隆抗体发生特异性结合。结论人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中已成功获得了表达,为进一步开展其生物学功能的研究奠定了基础。     

碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化

目的克隆碱性纤维素酶基因,构建酵母整合型表达质粒,在巴氏毕赤酵母中表达,并对重组菌的发酵工艺进行优化。方法应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因,克隆至酵母整合型表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833,并转化至巴氏毕赤酵母GS115。通过单因素实验及正交实验,确定重组酵母的最佳发酵培养基。在20L发酵罐中进行高密度发酵,观察碳源对批式发酵的影响,并检测在4种流加方式(连续恒速流加、间歇匀速流加、间歇递减流加、维持底物浓度流加)下的菌体干重及发酵液中的酶活性。结果重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833经酶切及DNA测序证明构建正确,其基因序列与嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶基因序列一致。最佳发酵培养基组成为6%葡萄糖、2%硫酸铵、12g/L磷酸二氢钾。碳源浓度对于重组酵母菌体生长及产酶至关重要。SDS-PAGE表明表达产物的相对分子质量约为103000。维持底物浓度的流加方式可获得最高的菌体干重(29.8g/L)及酶活力(24U/ml)。结论已成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌,并确定了维持底物浓度的流加方式为最佳发酵方式。