耐热木聚糖酶基因xyn11EM在大肠杆菌中的表达

将人工合成经密码子优化的11家族耐热木聚糖酶基因xyn11~(EM)克隆至表达质粒p ET-28a(+)中,获得重组质粒p ET-28a-xyn11~(EM)。将其转化Escherichia coli BL21(DE3),构建表达耐热木聚糖酶的重组工程菌E.coli BL21/xyn11~(EM)。用IPTG诱导表达重组木聚糖酶Xyn11~(EM)(re Xyn11~(EM)),酶活性可达47.5 U/m L。SDS-PAGE分析显示,re Xyn11~(EM)的表观相对分子质量为24 800。re Xyn11~(EM)的最适反应温度为70℃,在70℃以下稳定。最适反应p H为6.5~7.0,在p H5.0~8.0范围内稳定。大多数金属离子和EDTA对该重组酶的活性影响不大。re Xyn11~(EM)的Km和Vmax值分别为7.2 mg/m L和54.7 U/mg。结果表明xyn11~(EM)成功在E.coli中实现了异源表达,其良好的热稳定性具有较好的工业应用潜力。     

β-淀粉酶的表达与酶学性质

本研究在构建重组表达质粒p PIC-BBA的基础上,构建并筛选获得了高分泌表达大麦β-淀粉酶的重组巴斯德毕赤酵母GS-BBA。重组酵母在摇瓶发酵条件下,能够分泌表达180 U/m L的β-淀粉酶酶活力。进一步对该重组酶的酶学性质进行了分析,重组β-淀粉酶的最适作用温度为55℃,最适作用p H值为5.0,在不高于55℃和在p H 3.0~10.0之间有良好的热稳定性和p H值稳定性。重组酶水解淀粉的主要产物为麦芽糖,在普鲁兰酶的协助下,其水解淀粉形成麦芽糖的最大转化率为78.28%。     

短小芽孢杆菌碱性β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

以毕赤酵母密码子为基准,对短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因密码子进行优化,设计合成全基因序列,构建表达载体转入毕赤酵母中。结果表明,短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因已成功转入酵母菌中并分泌表达,诱导培养72h发酵液的酶活力可达25.39U/mL。重组酶最适反应温度45℃,最适pH 9.0,重组酶的K_m值1.26mmol/L,V_(max)为32.15μmol/(min·mg)。重组β-葡萄糖苷酶对大豆苷水解活性相对活力是pNPG的248%,转糖苷活性催化50%底物葡萄糖合成龙胆二糖,达34.25g/L。     

匍枝根霉cbh2基因的克隆表达与结构分析

采用反向PCR技术从匍枝根霉中克隆cbh2基因,该基因编码440个氨基酸的蛋白质。利用DS2.5软件进行同源模拟和建立分子动力学模型,研究cbh2催化纤维六糖水解过程中结合区(CBM)上的关键位点,催化区(CD)上催化隧道关键位点的相互依赖作用,水解β-1,4糖苷键,生成纤维二糖。把cbh2基因与p ET22-b(+)载体连接,实现了在E.coli BL21(DE3)中原核表达。通过镍柱层析、DEAE FF层析和G-75层析三步纯化法获得46 k Da的酶蛋白,比活力为4.67 IU/mg。纯化的重组酶具有高水平的催化活性,对微晶纤维素具有较好的水解特性,CBHII酶的Km为7.358(mg/m L)。研究CBHII酶的基本特性,其最适反应温度为50℃,最适反应p H为5.0,CBHII酶在p H 4~7下具有较宽的稳定性,在65℃以下热稳定性较好,在催化过程中保持较高的活力。     

粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中扩增得到马来酸顺反异构酶基因。将该基因连接到p ET24a载体上,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达。酶学性质研究表明,重组酶的比酶活力为48.01 U/mg。其最适温度为37℃,最适p H为8.4。在最适反应条件下,Km值为4.20 mmol/L,Vmax为1.27 mmol/(L·min),kcat为4.38 s-1,催化效率kcat/Km为1.04 L/(mmol·s)。研究结果进一步显示,马来酸顺反异构酶具备良好的热稳定性(55℃半衰期为1.5 h)及高达99%以上的转化率,为马来酸顺反异构酶的进一步研究和工业应用制备高纯度的富马酸提供了理论基础和支持。     

V1C定点突变木聚糖酶XynZF-2对酶热稳定性的影响

对来源于黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S的中温木聚糖酶Xyn ZF-2进行热稳定性改造,定点突变v1c,构建重组突变酶Xyn ZF-2V1C。重组原酶Xyn ZF-2与突变酶Xyn ZF-2V1C基因分别在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并进行酶学性质分析。结果发现,突变酶Xyn ZF-2V1C最适温度为50℃,相比原酶Xyn ZF-2最适温度提高了10℃;在45℃条件下的半衰期t45℃1/2,突变酶Xyn ZF-2V1C相对于原酶Xyn ZF-2提高了10 min;原酶Xyn ZF-2与突变酶Xyn ZF-2V1C最适p H均为5.0,p H稳定范围均为5.0~9.0,基本没有变化;原酶Xyn ZF-2和突变酶Xyn ZF-2V1C的Km分别9.96 mg/m L和12.4 mg/m L,Vmax分别为74.63 U/mg和90.91 U/mg。     

黑曲霉内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的分子克隆与特征解析

利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC 3. 2. 1. 89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因agh A在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了重组菌GS115(p PIC-aghA)。摇瓶培养条件下,重组酶Agh A的酶活为130 U/m L,高于大多数已报道的半乳聚糖酶的酶活。酶学性质的研究表明,该酶的最适反应pH值和温度分别为4. 5和45℃,且在pH 4. 0～6. 0或30～50℃具有较好稳定性。大部分金属离子和EDTA对重组酶Agh A的酶活没有显著影响; Fe3+对其活性有强烈的抑制作用;而Hg2+则可使Agh A几乎完全失活。该酶对半乳聚糖的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为400 mg/(m L·min)和0. 08 mg/m L。此外,重组酶Agh A还可以水解土豆浆,产生半乳二糖、半乳三糖和少量半乳四糖等低聚半乳糖。     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。     

大麦β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的异源表达

大麦来源的β-淀粉酶具有稳定性高和工业应用效果好的优点,被广泛应用于食品、酿造以及粮食加工,但是其制备成本高,价格较昂贵。该研究使用大肠杆菌异源表达大麦来源的β-淀粉酶。首先通过基因合成技术获得密码子优化的大麦来源的β-淀粉酶基因,将该基因通过质粒p ET28a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达获得重组β-淀粉酶。其次,对重组表达的β-淀粉酶和大麦中直接提取的β-淀粉酶进行酶学性质比较分析。结果表明,重组表达的β-淀粉酶其分子质量大小与大麦中β-淀粉酶一致,即59 k Da,重组的β-淀粉酶比酶活由大麦来源的588 U/mg降为285.5 U/mg,最适作用温度降低了10℃,最适p H保持一致。所以,大麦β-淀粉酶能够在细菌中高效表达,但是其酶学性质发生较大改变。     

一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因进行优化并构建在细胞内表达普鲁兰酶的重组毕赤酵母。优化后普鲁兰酶编码基因Bd P4在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达水平平均比优化前的普鲁兰酶基因Bd P提高4倍以上。筛选到1株表达水平较高的重组菌Pichia pastoris GS115/p PIC9K-Bd P4 WB54。在5 L发酵罐获得了初步优化的发酵条件:发酵液p H 4.5,在菌体量达到87 g/L时开始甲醇流加,采用溶氧(DO)恒定策略控制甲醇流加,DO控制在25%的水平,甲醇流加速率为9.9 m L/(L·h),搅拌转速控制在最大值800 r/min,通风量2 V/(v·m)。在优化条件下重组菌发酵酶活在2 000 U/m L以上。重组酶最适p H为4.0,最适作用温度50℃,在50和55℃下酶活半衰期分别为32和18 h。     

β-环糊精葡萄糖基转移酶突变基因的表达及突变酶酶学性质分析

通过对已构建的β-CGTase质粒载体采用一步PCR法进行大片段基因的定点突变,得到三个带有突变位点的质粒载体,并将其进行转化得到突变菌株。分析突变酶的酶学性质并与β-环糊精葡萄糖基转移酶比较,结果表明突变酶酶活力提高到原酶活力的1.6倍以上,且突变酶作用的最适温度60℃、最适p H6.0、在60℃下和p H5~8范围内均非常稳定,经方差分析突变酶与原酶的酶学性质差异不显著(p0.05),但是酶活力差异显著(p0.05)。     

cbh1重组菌的构建、产酶条件及酶特性分析

从匍枝根霉TP-02中克隆得到cbh1的c DNA,序列测定分析表明,该基因编码526个氨基酸的蛋白质。通过DS2.5同源模拟分析,CBHI酶的活性部位是一个"桶状"的隧道结构。将cbh1基因的c DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体p ET22b(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。采用两步层析法对重组的CBHI蛋白进行纯化,对纯酶的特性进行分析。结果表明:在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导终浓度为0.5 mmol/L,诱导温度为20℃,诱导时间为14 h,经过纯化后获得比活力为3.57 IU/mg。重组酶的最适反应温度和p H分别为55℃和5.5,在p H4.5~6.5的范围内稳定性较好,Fe3+和Co2+对其具有较强的激活作用;以微晶纤维素为底物,Km值为6.1 mg·m L-1。     

黑曲霉F5产高温α-糖化酶酶学性质及产酒精能力研究

通过对黑曲霉F5的代谢产物糖化酶进行了酶学性质的研究,实验结果表明,该酶的最适反应温度为65℃,最适反应p H值为5.0。在80℃条件下热稳定半衰期为2.67 min;酶促动力学中,Km值为0.836 mg/m L,V_(max)为2.255 mmo L/L·min。通过对1%的底物进行糖化实验,55 min后其DE值为67.5。产酒精能力测试中,料水比1∶3,添加30 IU/g原料的糖化酶,在65℃、p H5.0条件下酶解20 h,冷却接种1%液体酿酒酵母,以28℃培养9 d,酒精度为19.6%vol/60 g干物质,原料出酒率为32.2%(v/w)。     

米曲霉β-半乳糖苷酶系的克隆表达与酶学特性分析

本研究通过对米曲霉的3个β-半乳糖苷酶基因O158、AO及O76进行了克隆与表达,成功构建了相应的重组菌GS115(p PIC-O158)、GS115(p PIC-AO)和GS115(p PIC-O76),并获得相应的重组酶。进一步分析发现,重组酶O158、AO和O76的最适作用p H分别为4.0、5.5和7.0;最适作用温度均为50℃;在p H5.0~7.5之间或30~40℃均较为稳定。Mn2+对重组酶O158、AO和O76有明显的激活作用,而Fe2+、Cu2+和Zn2+则强烈抑制它们的酶活。O158、AO和O76只对乳糖具有水解与转苷活性,而且AO对乳糖的亲和力和催化效率均高于O158和O76。此外,在所试米曲霉菌种中不存在参照基因组中的β-半乳糖苷酶基因O42。本文系统地对米曲霉的3个β-半乳糖苷酶进行了异源表达及酶学性质的研究,为其大规模生产及工业化应用奠定了基础。     

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

碱性木聚糖酶在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

将教酒链霉菌L1105第10家族碱性木聚糖酶基因去除纤维素结合域(CBD)后将功能结构域基因xynAe SC克隆到毕赤酵母表达载体。经筛选得到重组工程菌GS1153-20,用甲醇诱导后产酶活力达到最高683±9U/m L。结果表明,重组木聚糖酶的最适p H为7.2,且在p H 6.2~8.6有较高的相对酶活;其最适温度为70℃,40~60℃时相对酶活力都在70%以上;重组酶Xyn Ae SC以燕麦木聚糖为底物时,酶活力最高,相对酶活力为桦木的259.7%±10.7%;对甘蔗渣木聚糖的酶活力最低,只有对桦木木聚糖酶活的16.0%±1.5%。研究表明,碱性木聚糖酶基因成功地在毕赤酵母中表达,且去除CBD域后,其酶学性质并未改变。     

海洋细菌低温葡萄糖氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

为解决细菌葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)活力较低的问题,提取和纯化了实验室保藏海洋细菌Citrobacters sp. 8-III的基因组DNA,并与现存GOD基因比对获得目的序列,以此序列为模板获得GOD基因。将人工合成并密码子优化的GOD基因亚克隆至载体p ET28a(+),构建重组表达载体p ET28a(+)-GOD并转化到E. coli BL21(DE3)中实现表达。经镍柱亲和层析得到较纯的重组GOD,并对其进行酶学性质研究。实验成功构建了产GOD的E. coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-GOD,目的蛋白约46 k Da。重组GOD酶活为2. 04 U/m L,该酶最适作用温度为25℃;最适作用p H为6. 0; K~+、Ni~(2+)对GOD的活性有明显促进作用;重组GOD添加至饲料中可加快雏鸡生长,且具备一定防腐功效。该研究首次将海洋细菌GOD基因导入大肠杆菌中,开拓GOD外源表达新的宿主。同时重组GOD具备低温酶特性,为其在饲料添加剂和低温领域应用奠定了基础。     

重组黏玉米谷氨酰胺转氨酶的酶学性质及其对乳蛋白的交联作用

目的:从重组大肠杆菌中分离纯化黏玉米来源的谷氨酰胺转氨酶(TGZ),研究其酶学性质及对乳蛋白的交联作用。方法:采用荧光测定法研究重组TGZ的动力学参数、最适反应温度、温度稳定范围、最适反应p H值、p H稳定范围及金属离子对酶活性的影响,明确该重组酶的酶学性质。以微生物源TGase(MTG)为对照,通过SDS-PAGE分析TGZ对乳蛋白的交联作用。结果 :在p H 8.0,37℃的条件下,重组TGZ的反应动力学常数Km为1.55μmol/L,最大反应速率Vmax为155/min。该酶的最适反应温度为45℃,具有较稳定的耐热性。该酶的最适反应p H值为8.0,具有较强的耐碱性。K+、Ca2+、Na+和Ba2+对该酶的活性具有促进作用,Fe3+、Cu2+和Zn2+的抑制作用较强。对乳中酪蛋白和乳清蛋白的交联作用表明酪蛋白是TGZ的良好底物。结论:重组TGZ的酶学性质为其进一步在相关食品中的应用提供了理论依据。     

基于温控载体表达胆固醇氧化酶

胆固醇氧化酶在医药检测、食品加工、农业生产等方面都有重要的应用价值。以来源于Rhodococcus sp.的胆固醇氧化酶基因为研究对象,构建于温控表达载体p Hsh上,免去了诱导剂的使用,采用温度调控使胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中成功表达。在摇瓶水平对酶的表达量进行优化,最终的酶量为855 U/L。使用镍柱将酶纯化,得到单一条带,相对分子质量约为55 k Da。分析其酶学性质,最适p H 7.0,在p H 5.0~7.0稳定;最适反应温度40℃,在50℃保温,其半衰期为6.9 min。以胆固醇为底物,在p H 7.5、37℃条件下测酶活,计算得动力学参数K_m为3.38 mmol/L,k_(cat)/K_m为6.09 s-1·(mmol/L)。