精氨酸缺陷型菌株发酵生产反式-4-羟脯氨酸

为了获得高产反式-4-羟脯氨酸的菌株,基于大肠杆菌的代谢网络模型的指导,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Δput A为出发菌株,通过基因敲除技术成功敲除arg B基因,阻断L-脯氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-脯氨酸合成的代谢流,构建了精氨酸缺陷型菌株E.coli BL21(DE3)Δput AΔarg B。同时转入表达质粒p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp,该质粒含有突变基因pro B2,该突变基因所编码的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制作用显著降低。摇瓶发酵结果表明,在外源添加600 mg/L L-精氨酸时,该重组菌株产反式-4-羟脯氨酸的量达到312.67 mg/L,较菌株E.coli BL21(DE3)Δput A/p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp提高了25.29%。     

提高产反式-4-羟脯氨酸工程菌产量的发酵策略

为了实现羟脯氨酸的高产,首先以缺陷型菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BH作为实验菌,通过单因素优化及正交试验,优化得到新的培养基配方及培养条件。其次通过基因工程手段引入透明颤菌血红蛋白VHB基因,构建菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BHV,进行高密度发酵。结果显示,发酵培养基为:麦芽糖10 g/L,甘油5 g/L,胰蛋白胨22 g/L,K_2HPO_44 g/L,FeSO_4(Fe~(2+)∶VC=1∶1) 5 mmol/L,MgSO_4·7H_2O 1.7 g/L,Nacl 3 g/L,Cacl_2 0.005 g/L;培养条件为:初始pH8.5,温度30℃,接种体积分数4%,转速220 r/min。此条件下,菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BH羟脯氨酸产量约为1 602 mg/L,约为优化前的1.4倍.在7 L罐发酵培养,菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BHV的羟脯氨酸产量约为18.3 g/L,与JM109ΔargB/pUC19-BH相比,提高了13.2%,说明VHB基因的引入有利于羟脯氨酸产量提高.     

无外源脯氨酸发酵产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及发酵优化

为实现无外源脯氨酸的条件下直接从葡萄糖转化生成反式-4-羟脯氨酸,本实验采用定点突变和基因共表达的方法构建重组大肠杆菌:首先对L-脯氨酸生物合成途径中的关键酶谷氨酸激酶进行定点突变E143A、K145A,以增强L-脯氨酸生物合成能力;然后引入脯氨酸4-羟化酶基因,通过两个基因的共表达可以实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化,而不再需要添加外源L-脯氨酸。得到的L-脯氨酸生物合成能力增强的菌株在摇瓶阶段L-脯氨酸的产量可达到1.4 g/L;pro BA2与hyp双基因共表达菌株的反式-4-羟脯氨酸产量为98.9 mg/L,比原始菌株提高了一倍,经发酵优化后得到培养基为:葡萄糖10 g/L,胰蛋白胨15 g/L,硫酸亚铁3 mmol/L,硫酸镁1 g/L,磷酸氢二钾3 g/L,氯化钙0.015 g/L,在这个培养条件下反式-4-羟脯氨酸的产量为220.0 mg/L,比优化前提高1.2倍。      

产3-羟脯氨酸重组菌的构建及发酵优化

顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)可用于合成多种抗癌药物,具有重要的商业价值,目前大多通过添加IPTG来诱导表达脯氨酸-3-羟化酶,采用两步法生物合成顺式-3-羟脯氨酸。作者通过目的基因优化设计,引入强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)来避免异源表达时的诱导剂使用,构建重组质粒p ES-Ptrp2-P3H,成功构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET21a-Ptrp2-P3H,优化后的脯氨酸-3-羟化酶基因(P3H)改变了168个碱基,GC含量由原来的64.83%降低到49.31%。该菌在初步优化培养基(葡萄糖1 g/d L,甘油0.125 g/d L,胰蛋白胨1.6 g/d L,(NH_4)_2SO_40.5 g/d L,K_2HPO_40.1 g/d L,NaCl 0.2 g/d L,FeSO_41 mmol/L,MgSO_40.5 g/d L,CaCl_20.015 g/d L,脯氨酸10 g/L,pH 7.5)上能一步法原位合成顺式-3-羟脯氨酸,摇瓶发酵24 h,产量0.8 g/L,比优化前提高一倍以上,为进一步开展顺-3-羟脯氨酸产业化提供了依据。     

产顺式-4-羟脯氨酸枯草芽孢杆菌工程菌的构建及发酵优化

顺式-4-羟脯氨酸（CHOP）是一种重要的手性结构物质,可广泛用于药物以及香料制造。本研究为开发CHOP的生物合成方法,将来源于中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的L-脯氨酸-4-羟化酶在枯草芽孢杆菌WB800N中实现了成功表达,构建获得了能够以L-脯氨酸为底物合成CHOP的工程菌株,进而对该菌株的发酵条件以及发酵组分进行了优化研究。结果表明:工程菌株的最适发酵温度为25℃,最适诱导剂浓度为1 mmol/L,最适发酵p H为5;在发酵体系中加入5 mmol/L硫酸亚铁和2.5 g/L L-脯氨酸时最有利于合成CHOP。在最优发酵体系下发酵60 h后,顺式-4-羟脯氨酸的产量可以达到120.2 mg/L。本文成功的构建了羟脯氨酸生产菌株枯草杆菌WB800 p HT-P4H,而研究结果为枯草杆菌工程菌发酵生产顺式-4-羟铺氨酸提供了基础。      

大肠杆菌中顺式-3-羟脯氨酸羟化酶的定向改造

对以L-脯氨酸为底物,产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET21a-ptrp2-H3P出发,通过易错PCR随机突变和定点突变处理,利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法筛选出2株H3P高产菌P-2-H3、P-9-D5。经基因测序后得到5个突变位点R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I,并在出发菌基础上对此5个位点进行单一定点突变,得到5个突变体TBTR58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I。发酵24 h测其产量找出3个优势突变位点。以TBT-R58C为出发菌,依次对另外2个位点进行定点突变。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突变体。发酵24 h产量达到了1125.3 mg/L。与重组菌相比,TBT-R58C-T83I-H89Y的产量提高了53.6%。     

γ-聚谷氨酸高产菌株选育及发酵条件优化

本研究从实验室保藏的产γ-聚谷氨酸地衣芽孢杆菌作为出发菌株,采用60Co-γ射线辐照和ARTP诱变协同复合诱变技术,筛选出了一株γ-聚谷氨酸高产菌株FA-22,产量达20.63g/L.通过对其培养基组分和摇瓶培养条件优化,确定了菌株FA-22的最适发酵培养基组分:L-谷氨酸20.0g/L、柠檬酸12.0 g/L、甘油9...     

sucA缺失型大肠杆菌菌株的构建与发酵条件优化

反式-4-羟脯氨酸在多领域具有重要应用价值。为了进一步提高反式-4-羟脯氨酸的产量,在已构建好的E. coli BL21(DE3)△putA的基础上,敲除基因sucA的同时插入密码子优化后的反式-4-羟化酶基因(hyp),并将构建好的质粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb导入该基因敲除菌株中。之后在摇瓶水平上,单因素优化发酵条件与发酵培养基的组分,并通过正交实验进一步确定敲除菌株的培养条件。结果表明:与含有同样质粒的原菌和两种单敲除菌E. coli BL21(DE3)△sucA、E. coli BL21(DE3)△putA相比,E. coli BL21(DE3)△putA△sucA双敲除菌具有最高的全细胞酶活,大约是原菌的2.6倍;在摇瓶水平上,发酵条件优化后,以100 mmol/L的L-脯氨酸为底物进行发酵,12 h后可得到1.08 g/L的羟脯氨酸,是优化前的3.87倍。     

β-甘露聚糖酶高产菌株发酵条件优化

从土壤中分离出1株产β-甘露聚糖酶的优良菌株Bacillus sp.QYW-1,具有发酵周期短且产酶活力高等特性,初始酶活力21.85 U/mL。在单因素实验对培养基及培养条件优化的基础上利用Plackett-Burman实验设计对影响产酶的重要因素进行筛选。实验发现,影响该菌株产酶的重要因素是魔芋粉、蛋白胨及硫酸镁。最陡爬坡实验和Box-Behnken实验得到响应面(RSM)优化的最佳培养基为:魔芋粉26 g/L,蛋白胨10 g/L,MgSO43.8 g/L,NaCl 10 g/L,KCl 6 g/L,NaNO36 g/L,K2HPO43 g/L,初始pH6.5。在此条件下菌株发酵产β-甘露聚糖酶酶活力为233.86 U/mL,与模型预测值相符,与单因素优化后的酶活力115.62 U/mL相比,提高了102%。     

1株产顺式-4-羟基-L-脯氨酸基因工程菌的构建及发酵初步优化

顺式-4-羟基-L-脯氨酸是一种可用于合成多种药物和香料的手性结构物质。通过对L-脯氨酸顺式-4-羟化酶基因的优化设计,并引入色氨酸串联启动子,构建出1株能表达L-脯氨酸顺式-4-羟化酶的重组大肠杆菌JM109/p EHC4,从而可以将游离的L-脯氨酸转化为顺式-4-羟基-L-脯氨酸。对该菌株进行摇瓶发酵优化,得出优选培养基为(g/L):葡萄糖10,甘油10,蛋白胨10,NaCl 6,FeSO_4·7H_2O 0.278,L-抗坏血酸0.528,(NH_4)_2SO_45,K_2HPO41,MgSO_40.2,CaCl_20.015,L-脯氨酸4。在该条件下发酵12 h,顺式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达到657.08mg/L,比优化前提高了3.76倍;在24 h时产量达到1 582.75 mg/L。研究结果为顺式-4-羟基-L-脯氨酸的微生物转化法生产提供了基础。     

Simultaneous production of cellulase and ferulic acid esterase by Penicillium decumbens with rice straw as the sole carbon source

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黑曲霉利用纤维素发酵生产柠檬酸培养基优化

以黑曲霉(Aspergillus niger)XSY0607作为生产菌株,利用纤维素作为碳源,通过液体深层发酵对其进行产柠檬酸研究。实验结果表明在7 L小型发酵罐中接入种龄为1 d的种子培养液、30°C下通风搅拌培养5 d的培养条件下,适合产酸的条件为:水稻秸秆粉6%、蛋白胨5%、聚乙二醇0.1%、初始pH值为6.5。该试验结果为黑曲霉XSY0607菌株以纤维素作为原料发酵生产柠檬酸的工业化生产和应用提供一定的参考依据。     

发酵性丝孢酵母发酵产油脂的碳源和氮源选择

以发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)为实验菌株,通过液体摇瓶发酵研究了碳源和氮源种类对其生长及细胞积累油脂的影响。结果表明:发酵性丝孢酵母以葡萄糖、乳糖、蔗糖及可溶性淀粉作为碳源,以牛肉膏、蛋白胨作为氮源发酵时,菌体生物量和细胞油脂含量均在发酵72 h时达到最大值,继续延长发酵时间不利于油脂积累。以硫酸铵为氮源,木糖为碳源时,菌体最大生长和细胞油脂最大积累不同步。发酵性丝孢酵母发酵产油脂宜选择硫酸铵作为氮源,葡萄糖作为碳源。     

工业化生产EPA和DHA藻株的选育

为筛选出高产EPA和DHA藻株,对8种海洋微藻(硅藻门3株,绿藻门2株,金藻门2株,红藻门1株)进行培养,测定了它们的最佳吸收波长和生长曲线.藻体在对数期末收获,经过提取脂肪,进行皂化、酯化处理后用气相色谱测定EPA和DHA的含量.结果表明,EPA高产藻株为新月菱形藻,产量为16 mg/L,占粗脂肪重的26%,占细胞干重的3.3%;等鞭金藻为DHA高产株,DHA产量为3.2 mg/L,占粗脂肪重的9.1%,占细胞干重的5.2%.     

甘氨酸、脯氨酸促进高渗环境下Yarrowia lipolytica发酵甘油产赤藓糖醇

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)可很好地发酵甘油生产赤藓糖醇。NaCl作为渗透压调节剂提升发酵体系渗透压有利于提高赤藓糖醇产量,但高渗会抑制酵母生长,延长发酵周期,降低生产强度。该研究以甘氨酸、脯氨酸为渗透压保护剂,在高渗环境下,研究其如何提升酵母细胞耐高渗能力。结果发现,Y.lipolytica可吸收胞外甘氨酸和脯氨酸并在胞内积累以抵御高渗胁迫,并显著提升高渗环境下的菌体量,促进赤藓糖醇的高效合成。在7 L发酵罐水平,初始渗透压为4.17±0.17 osmol/kg时,发酵初始添加30 mg/L甘氨酸和40 mg/L脯氨酸,发酵时间由108 h减少到90 h,赤藓糖醇最终产量达到了93.6±4.2 g/L,生产强度为1.04±0.05 g/(L·h),产物得率为0.49±0.03 g/g,分别比未添加保护剂时增加了4.12%,25.3%和4.26%。     

高产脂肪酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化

采用罗丹明B平板法和脂肪酶活力测定从张弓老酒大曲中分离筛选出一株高产脂肪酶菌株E-11,经形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。通过单因素和响应面试验设计对该菌株的产酶条件进行优化,结果表明,最佳产酶条件为葡萄糖3%、蛋白胨4%、初始pH值为8.0。优化后的脂肪酶活力达15.09 U/mL,是优化前产酶能力的1.2倍。