第二代肠道病毒71型(EV71)抗原国家标准品的建立

目的 建立第二代肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)抗原国家标准品,用于体外效力(EV71抗原含量)质量控制.方法 选取与第一代EV71抗原国家标准品相同来源的原料和冻干方法制备候选标准品(CS),经均匀性和稳定性考核合格后,分发给4个实验室,以EV71抗原国际标准品(WHO IS)和第一代EV71...     

polio/HAV灭活疫苗抗原国际标准品研制的经验及对EV71国际标准品研制的启示

<正>近年来,手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)已成为我国主要的公共健康问题,研发疫苗是控制HFMD的有效措施。目前我国3家企业完成肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗Ⅲ期临床试验,并均已上市。中国食品药品检定研究院(NIFDC)研发的EV71中和抗体国家标准品和抗原标准品在疫苗的研发和质控中发挥了积极作用。     

肠道病毒71型中和抗体的保护水平

目的通过检测乳鼠模型、健康婴幼儿和疫苗免疫后目标人群的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)中和抗体效价,为确定EV71疫苗保护水平提供基础数据。方法 6份不同EV71病毒株免疫血清经中和抗体准确定量后,分别通过两个EV71乳鼠攻毒模型,检测EV71中和抗体保护水平。采用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,分别对健康婴幼儿及疫苗免疫后血清进行中和抗体准确定量。结果在2个乳鼠攻毒模型中,6份免疫血清的中和抗体保护水平接近,ED50分别为10～50 U和6.1～54.2 U;婴幼儿人群7、12和24月龄抗体阳性率分别为45.0%、48.8%和56.8%,阳性人群的抗体效价分别为113.8、120.3和330.6U/m(l均值为173.2 U/m)l,母亲抗体阳性率和效价分别为86.7%和114.3 U/ml;中、高剂量疫苗2针免疫后,婴幼儿抗体阳性率均为100%,效价为356.0和1 136.2 U/ml,较婴幼儿人群自然感染水平高2.1～6.6倍。结论应用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,确定了以U/ml为单位的乳鼠攻毒抗体保护水平及婴幼儿人群抗体水平和疫苗免疫后抗体水平,为EV71疫苗免疫人群中和抗体保护水平的确定提供了依据。     

静注肠道病毒71型人免疫球蛋白(pH 4)的研制

目的研制静注肠道病毒71型人免疫球蛋白(pH 4)[Enterovirus 71 human immunoglobulin(pH 4)forintravenous injection,EV71-IVIG],用于治疗重症手足口病。方法采用细胞病变抑制法检测原料血浆的抗EV71中和抗体效价(EV71 neutralizing antibody titer,EV71-NT),确定EV71抗体血浆的筛选标准;从健康人血浆中筛选中和效价较高的EV71血浆,按《中国药典》三部(2010版)的生产工艺连续制备3批EV71-IVIG;以乳鼠模型评价EV71-IVIG的治疗效果,并以细胞病变抑制法检测EV71-IVIG对EV71临床分离株及CA16病毒的中和活性。结果从90批原料血浆中筛选出约3.8吨EV71抗体血浆,制备的3批EV71-IVIG符合《中国药典》三部(2010版)"静注人免疫球蛋白(pH 4)"的质量标准,EV71-NT为国内普通IVIG的4～5倍。0.5 mg EV71-IVIG即可充分保护经10 LD50EV71攻击的乳鼠,存活率达100%。EV71-IVIG对最近几年流行的EV71临床分离株有较高的中和活性。结论已成功研制EV71-IVIG,为重症手足口病患者的治疗提供了新的用药选择。     

开封农村地区婴幼儿中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型中和抗体水平及流行趋势

目的了解开封农村地区婴幼儿中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)中和抗体水平及流行趋势。方法应用微量细胞病变法,对2004年开封农村地区采集的349名7～30月龄婴幼儿血清进行EV71和CA16中和抗体检测。结果7～30月龄婴幼儿EV71和CA16中和抗体阳性率分别为36.7%(128/349)和36.5%(123/337),但二者流行趋势不同。EV71抗体阳性率由10～12月龄组的18.2%上升至25～30月龄组的81.3%,上升约4.5倍,抗体几何平均滴度(GMTs)也缓慢上升;CA16抗体阳性率由13～15月龄组的23.0%上升至22～24月龄组的47.6%,上升约2.1倍,GMTs在125～338之间波动;不同月龄婴幼儿中存在EV71和CA16混合感染的情况,19～24和25～30月龄组的EV71和CA16混合感染率显著高于7～12和13～18月龄组。结论开封农村地区婴幼儿中EV71和CA16中和抗体阳性率高,但二者上升的趋势不同,18月龄后的婴幼儿中EV71和CA16混合感染的比例显著升高。     

静注人免疫球蛋白(pH 4)中人肠道病毒71型中和抗体效价分析

目的对目前市售静注人免疫球蛋白(p H 4)(human intravenous immunoglobulin,IVIG)中的人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中和抗体效价进行筛查,为EV71相关疾病的被动免疫治疗提供参考。方法采用微量细胞病变法检测24批IVIG制品中的EV71中和抗体效价,并分组进行比较。结果 24批IVIG制品中的EV71中和抗体效价为841.6~1 024.3 U/m L,比活为16 832~20 486 U/g Ig G。4个季度生产的IVIG中EV71中和抗体效价差异无统计学意义(P0.05),病毒高发季与非高发季采浆生产的IVIG中EV71中和抗体效价差异也无统计学意义(P0.05)。结论 IVIG制品中EV71中和抗体效价可达50 000 U/瓶(蛋白浓度5%,50 m L/瓶),本研究为EV71相关疾病的被动治疗提供了临床参考依据。     

人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价

目的对人肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)中和抗体检测方法进行实验室评价,为该方法的标准化提供依据。方法 5个实验室按照统一制定的EV71中和抗体检测操作细则(SOP),应用A、B和C基因型的10株EV71病毒株,分别测定10份人免疫球蛋白、20份健康成人血浆和15份EV71动物高效价免疫血清样品中EV71中和效价,检测实验室内、实验室间重复性及不同EV71病毒株对中和抗体检测的影响。结果相同实验室应用各病毒株重复测定中和效价的最大值与最小值(Max-Min)倍数差均在4倍以内,3次重复试验结果间差异无统计学意义(P值均>0.05);不同实验室应用相同病毒株检测结果的Max-Min倍数差在4倍以内;不同实验室应用不同病毒株检测结果为:A型株与其他基因型病毒株中和效价的Max-Min差在192倍以内,B3与C4亚型的病毒株中和效价的Max-Min倍数差在64倍以内,C4亚型不同病毒株之间中和效价的Max-Min倍数差在16倍以内。结论按统一SOP操作后,EV71中和抗体检测方法应用相同毒株在实验室内和实验室间具有较好的重复性,而不同病毒株对中和效价的测定结果有较大影响。     

肠道病毒71型灭活疫苗分离纯化方法的研究进展

近年来,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染引起的手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)在我国持续流行,已成为我国现阶段重大的公共卫生问题之一。用疫苗防控EV71感染及HFMD的发生是最经济有效的方法。目前,EV71灭活疫苗研发进展较快,多家研究机构已完成临床Ⅲ期试验。为了获得更高纯度、收率及安全性的疫苗制品,病毒收获液的分离纯化技术十分关键。本文结合现阶段EV71灭活疫苗的生产工艺,对疫苗常用分离纯化方法的研究进展作一综述。     

6和8月龄婴儿接种肠道病毒71型疫苗的安全性及免疫原性比较

目的 比较6和8月龄婴儿接种肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)疫苗后的安全性及免疫原性。方法采用随机和对照原则选取山东、湖南、山西和陕西4个省份6和8月龄健康婴儿共540人,按月龄分为2组,分别在入组第0天采血并接种第1剂EV71疫苗,第30天接种第2剂EV71疫苗,60 d后采血。分离血清,微量中和试验检测抗体滴度;观察并记录每剂疫苗接种后全身及局部不良事件。结果 6和8月龄婴儿最终纳入分析人数分别为243和236人。总体安全性结果和分针次安全性结果均显示,6和8月龄组婴儿总体不良事件、全身不良事件及局部不良事件发生率差异均无统计学意义(χ²=0.000～5.234,P> 0.05)。6月龄组婴儿免疫前EV71中和抗体阳性率和几何平均滴度(GMT)均高于8月龄组,差异均有统计学意义(χ²_阳性率=18.812,t_GMT=2.51,P均<0.05);6和8月龄组婴儿EV71中和抗体阳转率分别为98.8%和99.2%,差异无统计学意义(χ²     

人肠道病毒71型VP4多抗的制备及其应用

目的制备人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP4多抗,并鉴定EV71空心颗粒(empty particle,EP)和实心颗粒(full particle,FP)。方法构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP4,诱导表达并纯化GST-VP4融合蛋白,免疫家兔制备多抗。ELISA法检测抗体效价,免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot法鉴定抗体特异性。应用制备的多抗经Western blot法区分EV71 EP与FP。结果质粒p GEX-6p-1-VP4经双酶切及测序鉴定证明构建正确,纯化后的GST-VP4融合蛋白相对分子质量约32 000,以包涵体形式存在。免疫家兔后可获得效价达10~(10)的多抗。兔抗EV71 VP4多抗可识别EV71原核表达及天然病毒颗粒中的VP0、VP4。结论抗EV71 VP4多抗可应用于EV71 EP及FP的鉴定,为EV71的基础研究及疫苗研发提供了新的工具及方法。     

北京市朝阳区部分婴幼儿肠道病毒71型感染率及手足口病发病情况分析

目的分析北京市朝阳区部分婴幼儿肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染率及手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)发病情况。方法选择北京市朝阳区小红门、酒仙桥社区6~35月龄健康婴幼儿为观察对象,共采集血清414份,检测中和抗体水平,并采集符合可疑肠道病毒病入选标准患者的咽拭子和肛拭子标本,应用RT-PCR法进行其他肠道病毒EV-G、柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus type A16,CA16)、EV71特异性核酸筛查。同时对观察对象进行1年随访,调查HFMD发病情况。将观察对象分为6~11月、12~17月、18~23月、24~29月、30~35月5个月龄组。结果 414名观察对象中,EV71中和抗体阳性39人,阳性率为9.42%,随着月龄的增加,阳性率呈递增趋势(P0.001);男性婴幼儿EV71中和抗体阳性率为8.90%(17/191),女性为9.87%(22/223),二者差异无统计学意义(P0.05)。414名观察对象中,29例肠道病毒阳性,其中女性14例,男性15例,男女发病比例为1.07:1;CA16感染率为31.03%(9/29),EV71感染率为17.24%(5/29),其他肠道病毒感染率为51.72%(15/29)。尚不能认为男女性别间肠道病毒感染及EV71和CA16感染的构成比有差别,也不能认为EV71中和抗体情况对肠道病毒感染率和EV71发病率有影响;随着年龄的增长,EV71感染人数呈递增趋势,而CA16则保持不变;小红门社区EV71中和抗体阳性率(12.25%)与酒仙桥社区(4.45%)差异有统计学意义(P0.05)。结论月龄越大,婴幼儿血清EV71抗体阳性率越高;小红门和酒仙桥地区检测到的HFMD患儿主要病原体为CA16和EV71,且CA16感染率高于EV71感染率。     

吉林省2011年手足口病死亡病例肠道病毒71型分离株全基因组基因特征分析

目的分析吉林省2011年手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)死亡病例标本中分离获得的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)毒株全基因组基因特征。方法采用分段RT-PCR法对2011年吉林省HFMD死亡病例EV71分离株JL2011-56全基因组进行扩增和测序。利用Clustal X2和MEGA5软件构建分离株JL2011-56与Gen Bank中27株参考株的全基因组序列和VP1区全基因组序列的进化树,分析Jl2011-56株的流行病学特征;同时与Gen Bank中12株C4a基因亚型参考株进行全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。结果 JL2011-56分离株属于C4a亚型,核苷酸序列和氨基酸序列与山东分离株SDLY107(JX244186.1)同源性最高,分别为99.2%和99.5%,与EV71原型株Br Cr的同源性分别为79.9%和95.7%。结论 JL2011-56分离株与山东株亲缘关系较近,可能存在共同的与中枢神经毒力相关的氨基酸突变位点。     

肠道病毒71型灭活疫苗的小鼠细胞免疫效果

目的评价肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠的细胞免疫效果。方法分别以不同剂量(1、2.5、5、10μg/ml,均含铝佐剂1 mg/ml)、不同剂型(含铝佐剂1 mg/ml或不含铝佐剂)、不同免疫剂次(单次免疫或加强免疫)EV71灭活疫苗经腹腔免疫小鼠,0.5 ml/只,均设铝佐剂对照组(仅注射铝佐剂1 mg/ml)。采用经典小鼠树突状细胞(dendritic cell,DC)培养方法制备正常小鼠DC,瑞氏染色法检测细胞形态,流式细胞术分析其表型及纯度;免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分离小鼠脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞,流式细胞术检测细胞纯度。ELISPOT法检测各组免疫小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ的水平;细胞因子试剂盒检测小鼠淋巴细胞培养上清及小鼠血清中细胞因子的水平。结果 DC形态不规则,表面树枝状突起形态不同,细胞核较大且不规则;DC纯度为(81.39±9.24)%,可高水平表达MHⅡ(I-A/I-E)类分子,中度表达CD86和CD40。CD4+、CD8+T细胞纯度分别为95.27%和94.08%。随着疫苗免疫剂量的增加,CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC显著增加,5μg/ml疫苗组达最大值,且明显高于其他组(P均0.05);5μg/ml疫苗组淋巴细胞培养上清中IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-5、TNF-α含量明显高于其他组(P0.05);1、2.5、5μg/ml疫苗组血清中IL-10含量明显高于铝佐剂对照组(P0.05),1μg/ml疫苗组明显低于2.5及5μg/ml疫苗组(P0.05)。含铝佐剂疫苗组CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC、淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α水平及血清中IL-10含量均明显高于无铝佐剂疫苗组(P均0.05)。加强免疫组CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC、淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α水平、血清中IL-10含量均明显高于单次免疫组(P均0.05)。结论 EV71灭活疫苗可诱导小鼠产生特异性细胞免疫反应,本实验为其进一步人体临床试验研究奠定了基础。     

肠道病毒71型灭活疫苗免疫原性比较

目的探讨新上市国产肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠体液免疫和细胞免疫应答特性。方法分别用我国3家企业生产的EV71灭活疫苗(V1、V2、V3)按0、14 d程序免疫BALB/c小鼠,采用体外微量中和试验检测血清单剂和2剂免疫后14 d的EV71中和抗体效价,ELISA法检测2剂免疫后14 d的小鼠脾单个核细胞(mononuclear cells,MNC)分泌细胞因子水平。结果 3家EV71疫苗1剂免疫后即可诱导90%以上小鼠产生EV71中和抗体阳转,V1疫苗组诱导的中和抗体效价显著高于V2和V3疫苗组,GMT分别为627.1、25.9和75.3(P0.01);2剂免疫后中和抗体阳转率均为100%,V1和V3疫苗组抗体效价相近,GMT分别为1 752.9和2 013.5(P0.05),均显著高于V2疫苗组(GMT为228.2,P0.001)。3家疫苗均可诱导BALB/c小鼠产生Th1和Th2类细胞因子应答,但细胞因子种类具有差异,V1和V3疫苗组诱导小鼠分泌IFNγ的水平显著高于V2疫苗组(P0.05);3个疫苗组间IL-2分泌水平差异无统计学意义(P0.05),IL-4和IL-5分泌水平与对照组相比,差异无统计学意义(P0.05);V2疫苗组诱导小鼠分泌的IL-6水平显著高于V3疫苗组(P0.01);V3疫苗组诱导小鼠分泌的IL-10水平显著高于V1和V2疫苗组(P0.05)。结论 3家EV71疫苗均可诱导小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,但呈现出不同的免疫应答特征。     

人肠道病毒71型病毒样颗粒的制备及免疫原性评价

目的 利用巴斯德毕赤酵母制备重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并评价其免疫原性.方法 将EV71的P1和3CD基因插入巴斯德毕赤酵母基因组中,构建EV71 VLPs表达质粒,转化巴斯德毕赤酵母KM71感受态细胞,Western...     

抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。     

高效价抗肠道病毒71型兔血清的制备及鉴定

目的制备高效价的抗肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)兔血清。方法分别用RD细胞和Vero细胞培养EV71,纯化后,将经甲醛灭活和未灭活的EV71抗原分别加入佐剂或不加佐剂,经不同途径(肌肉、皮下、腹腔)免疫家兔,每周采血,分离血清,分别采用ELISA、免疫双扩散、免疫荧光和中和抗体试验检测兔血清抗体效价,并分析不同方法检测兔血清抗体结果的相关性。结果未灭活和灭活的纯化EV71抗原加弗氏佐剂后,经皮下或肌肉途径免疫家兔均可获得高效价的抗EV71兔血清,其中加弗氏佐剂的灭活疫苗经皮下途径免疫获得了最高滴度的中和抗体;当抗血清ELISA效价达到或接近1∶108,免疫双扩散效价达到或接近1∶512,抗血清1∶2 000稀释后荧光强度荻时,可进行免疫家兔的全血采集;不同方法免疫家兔全血采集的血清中和抗体效价为29 406~1 280 652 U/0.2 ml;免疫双扩散检测与中和抗体和免疫荧光检测结果的相关性较高。结论获得了高效价的抗EV71兔血清,为EV71疫苗抗原的相关检定创造了条件。     

肠道病毒71型鼠源性中和单克隆抗体的制备

目的制备肠道病毒71型(enterovirus A 71,EV71)鼠源性中和单克隆抗体。方法以灭活EV71病毒液为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得抗EV71单克隆抗体;ELISA法检测抗体的特征,获得具有高效结合性的单克隆抗体;SDS-PAGE和Western blot法鉴定Protein A纯化的抗体;通过体外和体内中和试验鉴定抗体的中和特性。结果得到3株针对EV71 VP1的高效结合性单克隆抗体15H7、15G7和6G2,且15H7经中和试验证明具有较强的中和活性。结论成功制备了EV71鼠源性中和单克隆抗体,其在小鼠体内能成功地抑制病毒增殖。     

肠道病毒71型灭活疫苗质量一致性评价

<正>近年来,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)引起的手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)已成为我国严重的公共卫生问题~([1-2])。为防控EV71引起的严重HFMD流行,在国家科技支撑项目和重大新药项目的支持下,历经8年攻关,由中国医学科学院医学生物学研究所(简称昆明所)和北京科兴生物制品有限公司(简称科兴公司)研发的创新型     

肠道病毒71型灭活疫苗灭活验证超速离心条件的优化

目的优化肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗灭活验证超速离心条件,为EV71灭活疫苗灭活验证样品的处理提供实验依据。方法在不同转速(45 000、40 000、35 000、30 000、25 000 r/min)和时间(120、90、60、30 min)条件下对EV71收获液进行超速离心,检测离心前和离心后病毒液的滴度,计算回收率,比较不同条件下离心前后病毒回收效果。结果在转速相同或离心时间相同的条件下,EV71的沉淀效果与离心时间或离心转速呈正相关(R~2从0.77和0.88分别增大到0.99),其中,当离心转速超过40 000 r/min时,不同离心时间下病毒的回收率均在90%以上,当离心时间为120 min,离心转速为45 000 r/min时,病毒的沉淀效果最好,回收率最高,达98%。综合离心时间因素,选择离心条件为45 000 r/min-60 min较适宜(回收率为97%),与45 000 r/min-120 min相比,差异无统计学意义(P>0.05);如将时间减为45 000 r/min-30 min,与其他3组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EV71的沉淀效果与离心转速和离心时间呈正相关,即随着离心转速增大和离心时间的延长,病毒的沉淀效果越好、回收率越高。