HSP70基因在人胃癌、宫颈癌中高表达和癌变关系的研究

采用人的HSP70基因探针P17与人的胃癌、宫颈癌的癌组织中提取的RNA进行northern杂交，结果均出现了比正常组织较强的杂交信号。表明HSP70基因在癌变组织中呈现高表达，与组织的癌变程度表现出了很强的相关性，为进一步了解细胞的癌变机理和对癌症的预防及基因治疗提供了可靠的实验依据。     

乳酸脱氢酶A(ldha)基因的克隆与原核表达

乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶,在厌氧条件下能催化丙酮酸生成乳酸;当动物体内缺乏葡萄糖时,还可氧化乳酸生成丙酮酸并经葡萄糖异生途径转变为葡萄糖。通过反转录PCR获得了Hela细胞中的ldha基因,并将它克隆到pET28a(+)载体上,获得重组表达载体pET28a(+)-ldha。重组质粒通过转化法转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中。SDS-PAGE分析表明,在1.0 mmol·L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了一条分子质量约为36 kDa的目标蛋白。     

耻垢分枝杆菌海藻糖合成酶基因TreS的克隆及其在大肠杆菌中的表达

耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）在环境胁迫下具有合成海藻糖的能力。实验采用PCR的方法，克隆了来源于耻垢分枝杆菌的一段核苷酸序列，与已报道的海藻糖合成酶有60％以上同源性，推测该基因的编码产物具有海藻糖合成酶的活性，为进行其功能验证而在大肠杆菌中进行了表达。目的蛋白以可溶性蛋白为主，约占细胞可溶性总蛋白48％，为目前相关报道的最高值。经活性测定，表达的重组酶无需复性，能够催化麦芽糖生成海藻糖，在20℃反应20h对麦芽糖的转化率可达61％，具有较高的应用价值。     

人食管、胃、大肠癌组织中HSP70蛋白表达分析

采用Western Blot方法,检测、分析人食管、胃、大肠的正常组织、癌旁组织及癌组织中的HSP70蛋白表达差异。在不同器官的不同组织中,HSP70的表达情况有较大差异。在人胃、食管、大肠三个器官的正常组织、癌旁组织和癌组织中,HSP70的表达量依次升高。消化道癌组织中大量表达的HSP70蛋白可能在上述组织癌变进程中起一定作用,为深入研究消化道肿瘤的致病机理和治疗提供理论依据。     

HSP70的结构、特性和功能研究进展

HSP70蛋白是受热等因素刺激后而诱导产生的蛋白质，是热休克蛋白家族中最重要的一员。是在生物进化中高度保守的蛋白质分子家族，它存在于各种生物细胞内，具有保护细胞生存和进行正常生命活动的生物学功能。     

蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达

以本实验室分离筛选的高产PLC的蜡样芽胞杆菌深圳株754—1为供体菌，以大肠杆菌DH5仅和BL21（DE3）为受体菌，构建高效表达胞内PLC的工程菌。以754-1菌基因组为模板。经PCR扩增，将得到的PLC基因连接到T载体上，转入大肠杆菌DH5仅。经Amp抗性筛选的阳性克隆子提取重组质粒，双酶切，回收含PLC基因的片段并将其克隆到pGEX-KG载体，获得重组质粒pGEX-KG-PLM，该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，在分子量为38kd处有一条明显的表达带。     

重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达

根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子质量约为31ku的特异条带。经过Western blotting分析鉴定,结果显示重组海参溶菌酶成功在大肠杆菌中表达,并且有部分可溶性蛋白,占总菌体蛋白约10%。这些结果为进一步研究海参溶菌酶的作用机理奠定基础。     

br基因的克隆及表达

细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,BR)是嗜盐菌细胞膜上唯一的一种光能转换色素蛋白,BR以视黄醛(retinal)作辅基,在光诱导下吸收光子后会产生一系列的光循环中间体,最后又回到原始状态．由于BR这种独特的分子结构和光循环过程,及其作为一种具有光敏特性的蛋白质生物分子,可嗵过生物学技术进行改造,正引起光子学研究及生物学研究领域的高度注意．从Genbank查询br基因的全序列,然后采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术,采用DNA star软件辅助设计了上下游引物,以嗜盐菌(Halobactrium Halobium)的基因组DNA为模板克隆获得了完整的细菌视紫红质基因br,并且将经测序鉴定的br基因重组到原核高效表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coli．,将阳性转化子经IPTG诱导表达获得BR与GST(谷胱苷肽转移酶)的融合蛋白后,提取蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western印迹反应,检测表达结果为阳性,且表达蛋白的大小与预想的一致．     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

HCV e2-3pcx融合基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

构建了丙型肝炎病毒e2-3pcx融合基因的原核表达载体pET28b(+)-e2-3pcx,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。IPTG诱导融合蛋白高效表达。经SDS-PAGE电泳分析,结果表明在43 ku处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。     

云南宾川脐橙蔗糖转运基因的克隆和表达分析

蔗糖不仅是植物光合作用的主要产物,也是植物体内运输的主要物质和许多果实中糖积累的主要形式,对果实品质的形成有重要影响.在蔗糖合成的路径中,蔗糖合成酶(Sucrose Synthase)和蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate Synthase)是蔗糖代谢的关键酶.在前人报道苹果蔗糖转运基因的基础上,对云南宾川脐橙蔗糖转运基因进行克隆和表达分析,并对其相关的生理生化指标(蔗糖等糖含量、蔗糖合成代谢相关酶活性等)进行测定.研究结果显示,在宾川脐橙果实接近成熟时蔗糖转运基因的表达量最高,成熟脐橙中果肉的蔗糖含量比果皮中高,而成熟脐橙果肉和果皮中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性差异不显著.     

松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46,克隆基因与已报道的纤维素酶基因BXC10（GenBank登录号：FJ598020.1）的同源性高达99%,将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-BXC。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2＋-NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶,DNS法进行的活性测定表明,部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性,其最适温度为45℃,最适pH为4.0。     

家蚕小热休克蛋白22.6基因的生物信息学分析及其原核表达

小热休克蛋白家族成员在结构上变化很大,是细胞或生物体被多种类型的胁迫所诱导新合成的或含量增加的一类蛋白质,目前研究相对较少。从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条序列,经过Blast比对和保守结构域分析后发现该蛋白属于家蚕小热休克蛋白,将其命名为BmHSP22.6;通过PCR扩增该基因的ORF序列,将其克隆到pET28a(+)表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,获得重组质粒pET-28a-BmHSP22.6。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得工程菌,用终浓度为1 mM的IPTG诱导目的基因表达。用镍柱分离上清裂解液,获得纯化的目的蛋白。     

一种新型琼胶酶AgaB的基因克隆及生物信息学分析

利用从青岛近海发现的一株高产琼胶酶的假别单胞菌CY24(Pseudoaltero-monassp.CY24)建立基因组DNA文库后,用水解圈的方法从中筛选到一个具有琼胶酶活性的阳性克隆pBA1。pBA1的序列分析结果表明,插入DNA片段的长度为6.7 kb,含有4个推测读码框架,并利用亚克隆法确定了琼胶酶的编码基因agaB。agaB基因的开放阅读框架为1 437 bp,编码478个氨基酸,理论分子量为50.9 kDa,在N末端有一个包含38个氨基酸的信号肽。推测的成熟蛋白质的分子量和等电点分别为47.2 kDa和4.83。AgaB的氨基酸序列与已知蛋白质包括所有的糖苷水解酶序列完全没有相似性;HCA的蛋白质二级结构分析结果表明,AgaB不同于其他已知琼胶酶。因此,推测AgaB为一新型的琼胶酶,代表一个新的糖苷水解酶家族。     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....