脐带间充质干细胞治疗严重膝骨关节炎的对照研究

目的:对照透明质酸钠（sodium hyaluronate or hyaluronic acid,HA）与人源脐带间充质干细胞（human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）膝关节腔两种注射方法治疗中重度膝骨关节炎(osteoarthritis,OA),观察关节疼痛、功能的疗效、放射学变化以及安全性。方法:采用随机半盲平行对照的研究方法,将44例中重度膝骨关节炎的患者分为3组：A组16例,5次透明质酸钠注射组;B组15例,2次hUC-MSCs注射组;C组13例,4次hUC-MSCs注射组。观察指标：静止VAP评分,美国膝关节协会 (AKS)的膝骨关节炎关节性和功能性评分,Kellgren-Lawrence（K-L）放射学评估。随访期12个月,治疗前和治疗后3、6、12个月进行随访记录临床体检、观察指标结果及安全性评估;治疗前和治疗后6、12个月进行实验室检查和膝关节X片检查。结果: 3组治疗前比较,静止VAP评分、AKS关节性评分、AKS功能评分、K-L放射学评估均无统计学差异（P＞0.05）。治疗后3、6、12个月时,3组间静止VAP评分、AKS关节性评分、AKS功能评分比较均有统计学差异（P＜0.05,P＜0.01）;K-L放射学评估各时段各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论:hUC-MSCs移植治疗严重OA较透明质酸钠能更快速、更显著、更持久地减轻关节疼痛、改善关节功能,4次注射疗效优于2次注射。     

几种抗类风湿性关节炎药物对佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞酸敏感离子通道的表达影响及作用

目的:观察几种抗类风湿性关节炎(RA)药物对佐剂性关节炎(AA)大鼠关节软骨中的酸敏感离子通道(ASICs)表达的影响, 探讨抗RA药物对关节软骨的保护作用。方法:将大鼠随机分成正常组、AA模型组、阿司匹林(50 mg/kg)组、地塞米松(0.2 mg/kg)组、雷公藤多苷(50 mg/kg)组和左旋咪唑(10 mg/kg)组。弗氏完全佐剂(CFA)致炎后第10天起,AA大鼠出现继发性炎症, 此时地塞米松组腹腔注射地塞米松, 其它用药组分别灌胃相应的受试药物, 正常组与模型组灌胃等容量的无菌注射用水, 连续7d。实验结束后, 光学显微镜观察关节病理变化;用半定量RT-PCR和Western blotting分析常用药物对AA大鼠关节软骨细胞中ASICs表达的影响;用半定量RT-PCR方法分析常用药物对AA大鼠关节软骨中的蛋白聚糖体(aggregate proteoglycan, aggrecan)表达的影响;免疫组织化学技术检测常用药物对AA大鼠关节软骨中的Ⅱ型胶原蛋白合成的影响。结果:经过治疗后, 各用药组能明显抑制AA大鼠的继发性足肿胀。阿司匹林能显著抑制AA大鼠关节软骨细胞ASICs的表达, 其它用药组对ASICs无明显抑制作用。各用药组能明显升高AA大鼠关节软骨细胞基质成分Ⅱ型胶原和aggrecan表达量, 其中阿司匹林作用显著。结论:阿司匹林可能通过抑制ASICs的表达而抑制AA大鼠关节软骨的破坏。     

脂肪间充质干细胞的生物学特性及潜在临床应用

脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是来源于脂肪组织的多能干细胞。具有自我更新和多向分化能力，且可塑性强、免疫原性低、可旁分泌多种生物活性因子，同时致畸致瘤风险也比较低，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。ADSCs已经广泛用于骨及软骨组织的修复，皮肤损伤的修复、糖尿病和免疫调节等疾病治疗。本文就ADSCs的生物学特性及临床应用进展作一综述。     

间充质干细胞对自身免疫病治疗作用研究进展及机制探究

间充质基质/干细胞（mesenchymal stromal/stem cells, MSCs）是一种存在于人体多种组织和器官间质中的成体干细胞,能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞。MSCs的来源比较广泛,包括骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带和胎盘、外周血、皮肤和滑膜液。国内外研究表明,MSCs在多种自身免疫病的治疗具有重要研究价值和巨大应用潜力。MSCs为医学界推开了一扇新的大门,引发了人们对MSCs移植治疗自身免疫病试验的研究热潮。然而,鉴于当前MSCs的一些局限性,真正安全地应用到自身免疫病的治疗还需要更大体量和更为深入的试验和临床数据支持。本文将对MSCs在自身免疫病的治疗作用及其产生作用的可能机制进行综述。     

骨髓间充质干细胞通过抑制铁死亡改善大鼠重症急性胰腺炎相关肺损伤

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肺组织内细胞铁死亡的抑制作用及其潜在机制。方法：选择3周龄SD雄性大鼠提取、培养BMSCs。将30只6周龄SD雄性大鼠随机分为5组：假手术组（Sham）、胰腺炎组（SAP）、PBS对照组（SAP+PBS）、干细胞治疗组（SAP+BMSCs）、干细胞联合Nrf2阻断剂ML385治疗组（SAP+BMSCs+ML385）,每组6只。使用牛磺胆酸钠（NaT）构建大鼠SAP模型。于造模前2 h,SAP+BMSCs+ML385组腹腔注射ML385（5 mg/kg）;于造模后6 h,SAP+BMSCs组和SAP+BMSCs+ML385组尾静脉注射BMSCs（1×107/只）,SAP+PBS组尾静脉注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS）。3 d后处死大鼠,取胰腺、肺组织和血清。H&E染色观察组织损伤情况。检测血清中淀粉酶、脂肪酶活性和炎症因子水平,肺组织中铁含量、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）活性。检测肺组织铁响应元件结合蛋白2（IREB2）、铁蛋白重链1（FTH1）、长链脂酰CoA合成酶4（ACSL4）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）等铁死亡相关蛋白表达,以及PI3K/AKT/Nrf2通路相关蛋白表达。结果：NaT诱导后大鼠血清淀粉酶、脂肪酶活性、促炎因子水平和病理评分明显升高（P<0.05）。BMSCs移植能够明显减轻上述指标（P<0.05）。相比SAP组,BMSCs治疗组肺组织铁、MDA水平降低,GSH活性升高,IREB2、ACSL4蛋白表达降低,FTH1、GPX4及SLC7A11蛋白表达升高（P<0.05）;ML385能够部分抵消BMSCs移植产生的抗脂质过氧化作用（P<0.05）。BMSCs移植上调了肺组织PI3K、p-AKT总蛋白和Nrf2核蛋白的表达（P<0.05）。 结论：BMSCs移植能够有效减轻SAP相关肺损伤的全身炎症反应和局部组织损伤,抑制肺组织铁沉积和脂质过氧化,其抗脂质过氧化作用可能与PI3K/AKT/Nrf2通路有关。     

鼠神经生长因子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的: 观察鼠神经生长因子(mNGF)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响。方法: 4周龄健康SD大鼠60只,按随机数字表法分为治疗组(n=30)和正常对照组(n=30)。治疗组在常规培养的基础上加入浓度为 0.1 μg/mL mNGF作为诱导液。将培养的第3代BMSCs制成单细胞悬液,诱导后3 d,观察细胞形态变化,行神经元特异性烯醇酶(NSE) 免疫荧光检测,计算阳性率。结果: 正常对照组细胞仅有少量NSE的表达,治疗组细胞表达NSE阳性率较对照组细胞显著增加(P＜0.01)。结论: mNGF可诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞分化。     

间充质干细胞源性外泌体及其在创面修复中的研究进展

外泌体（exosomes）是细胞分泌的膜性囊泡,其作为干细胞旁分泌因子参与了创面修复。该文对近年间充质干细胞外泌体促进创面修复的研究进展进行综述,外泌体通过调控炎症反应、促进细胞增殖及血管再生、调控细胞外基质重塑及抑制瘢痕形成等多种途径全面地参与了创面修复。工程化干细胞可提高其外泌体功效和产量,为外泌体临床应用带来了巨大的潜力和优势。     

纯钛表面PPy／rhBMP-2复合涂层对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响

采用水溶液恒电流电化学聚合法在纯钛表面制备了聚吡咯／重组人骨形成蛋白涂层（Ti／PPy／rhBMP-2）。利用循环伏安扫描分析涂层氧化还原性质，^125I蛋白质标记法检测rhBMP-2掺杂量，表面粗糙度仪、扫描电子显微镜检测涂层微观形貌。通过对骨髓间充质干细胞（BMSCs）在Ti／PPy／rhBMP-2表面增殖、分化能力的检测，评价Ti／PPy／rhBMP-2对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。结果表明，rhBMP-2能够以聚电解质阴离子方式稳定地掺杂于PPy结构中，并且所生成的涂层表面粗糙度高且结构疏松。Ti／PPy／rhBMP-2中掺杂固定的rhBMP-2依然保持着其骨诱导活性，能够促进BMSCs的增殖、分化。     

脂多糖刺激的骨髓间充质干细胞来源外泌体改善小鼠心肌梗死后炎症和纤维化

目的: 探讨脂多糖（LPS）刺激下的骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源的外泌体对小鼠心肌梗死（MI）后的治疗作用。方法: 流式成像细胞分析术鉴定BMSCs的表面标记分子，油红O和茜素红染色于镜下观察成骨成脂分化能力。LPS刺激BMSCs 48 h，提取细胞培养上清外泌体，用透射电镜和粒度分析仪捕捉其形态和粒径大小，流式细胞术和Western blot检测特异性表面标记分子及蛋白表达。建构小鼠MI模型并予以外泌体心脏局部注射，利用心脏超声、组织病理切片和PCR评价治疗结果。结果: 分离的BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD73、CD105，未表达HLA-DR、CD14、CD34、CD45，具有成骨成脂分化能力。Western blot检测到外泌体表达Alix、HSP70、Flotillin-1蛋白，流式成像仪检测到外泌体膜表面的CD63、CD9和CD81标记分子，粒径众数为69.2 nm。LPS刺激下BMSCs产生的外泌体注射小鼠心脏后，与PBS注射的MI对照组比较，心脏超声评价7天和28天的射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）都显著增大（P<0.01,P<0.05），在第28天的舒张末期容积（LVEDV）和收缩末期容积（LVESV）均显著减小（P<0.05），Masson染色显示纤维化面积减小（P<0.01），PCR检测到炎症因子IL-6、IL-1β、转化生长因子β（TGF-β）和趋附因子CCL2表达减少，CX3CL1表达增多，术后第14天最为明显。结论: LPS刺激的BMSCs来源外泌体可以改善小鼠MI后心肌收缩功能和纤维化，降低炎症因子表达量。     

胰高血糖素样肽-1及其类似物EX-4促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化

目的: 观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其受体激动剂exendin-4(EX-4)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法: 取大鼠股骨和胫骨全骨髓,采用贴壁法分离BMSCs并传代至第三代,培养2 d后分成4组:BMSC组、诱导成骨组(osteoblast induced medium,OIM组)和诱导加药组,诱导加药组细分为GLP-1(10^-9~10^-7 mol/L)或EX-4(10^-9~10^-7 mol/L)的不同浓度组,MTT法检测细胞增殖能力;测定碱性磷酸酶(ALP)活性;通过ALP染色及茜素红染色观察药物诱导BMSCs向成骨细胞分化、矿化的效果;采用RT-PCR方法检测ALP和Runx2成骨相关基因的表达情况。结果: 与诱导对照组相比,GLP-1及EX-4各浓度处理组呈剂量依赖性显著促进细胞增殖(P<0.05);ALP染色与茜素红染色结果显示,对照组无显色或显色不明显,而GLP-1及EX-4组均有阳性显色。GLP-1及EX-4可以显著提高ALP活性,并提高Runx2、ALP的表达水平。结论: GLP-1及EX-4不仅能够直接促进BMSCs增殖,并促进其向成骨细胞分化,GLP-1及EX-4可能在骨重建中发挥重要的作用。     

人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞对急性肝功能衰竭大鼠肝组织再生及Wnt/β-catenin信号表达的影响

目的:分析人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞（BMSC）对急性肝功能衰竭（ALF）大鼠肝组织再生及Wnt/β-catenin信号表达的影响。方法:选取SPF级Wistar雄性大鼠66只,其中1只行BMSCs培养,随机选取50只大鼠制备ALF模型,24 h后随机选取其中5只断颈处死,依据大鼠肝功能与组织病理学判别其是否成功造模。剩余15只大鼠将等剂量0.9%氯化钠溶液腹腔注入,作为正常组。成功造模的45只大鼠随机分成3组,分别为BMSCs组、模型组及人参皂苷诱导BMSCs组,每组各15只。造模后6 h,模型组和正常组大鼠由尾静脉注入1 mL细胞培养液,BMSCs组注入1 mL BMSCs悬液（细胞浓度2.0×109/L）,人参皂苷诱导BMSCs组注入1 mL人参皂苷诱导分化BMSCs悬液（细胞浓度2.0×109/L）,连续给药10 d。观察大鼠肝脏组织病理状况,血清总胆红素（TBil） 、AST、ALT、TNF-α、IL-6含量,肝组织内Wnt7b、Wnt7a及Wnt2基因表达。结果:正常组大鼠肝细胞无坏死、变性,整齐排列,肝小叶结构清晰,汇管区内没有炎性细胞浸润;模型组大鼠肝细胞表征为广泛坏死,肝小叶内全部肝细胞溶解坏死,网状的支架发生塌陷,汇管区和周边存在大量粒细胞、单核细胞与淋巴细胞的浸润,残余肝细胞变性、肿胀且伴随胆汁淤积;BMSCs组及人参皂苷诱导BMSCs组大鼠肝小叶结构趋向完整,肝细胞坏死、变性数量减少,汇管区内有少许炎性细胞浸润,人参皂苷诱导BMSCs组又优于BMSCs组。和正常组相比,模型组大鼠血清TBil、AST、ALT、IL-6及TNF-α含量上升;和模型组相比,BMSCs组、人参皂苷诱导BMSCs组大鼠血清TBil、AST、ALT、IL-6及TNF-α含量降低;和BMSCs组相比,人参皂苷诱导BMSCs组大鼠血清TBil、AST、ALT、IL-6及TNF-α含量降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。和正常组相比,模型组大鼠肝组织内Wnt7b、Wnt7a、Wnt2 mRNA相对表达量降低;和模型组相比,BMSCs组、人参皂苷诱导BMSCs组大鼠肝组织内Wnt7b、Wnt7a、Wnt2 mRNA相对表达量升高;和BMSCs组相比,人参皂苷诱导BMSCs组大鼠肝组织内Wnt7b、Wnt7a、Wnt2 mRNA相对表达量升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:人参皂苷诱导BMSCs可显著改善ALF大鼠肝功能,其作用机制可能为激活Wnt/β-catenin信号通路加速肝脏再生。     

烟酸姜黄素酯对低剪切应力诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及相关机制

目的: 探讨烟酸姜黄素酯（curcumin nicotinate,CN）对低剪切应力（low shear stress, LSS）诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）凋亡的影响及机制研究。方法: 运用平行平板流动腔建立LSS诱导的HUVECs凋亡模型。采用Hoechst33258荧光染色,流式细胞术检测CN对LSS诱导的HUVECs凋亡的影响。Western blot检测CN对LSS诱导的HUVECs中前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）蛋白表达的影响。结果:Hoechst33258荧光染色结果显示,与静态培养组比较,LSS组（3 dyne/cm2,12 h）内呈现凋亡状态的HUVECs明显增多。与LSS组比较,各CN+LSS组内呈现凋亡状态的HUVECs明显减少,并且呈现浓度依赖性。其中以20 μmol/L CN+LSS组凋亡细胞数最少;流式细胞术结果显示,与静态培养组比较,LSS组HUVECs凋亡率明显增加,差异有显著统计学意义（P<0.01）;与LSS组比较,各CN+LSS组HUVECs凋亡率明显减少,并且呈现浓度依赖性,其中以20 μmol/L CN+LSS组HUVECs凋亡率减少最为明显,差异具有显著统计学意义（P<0.01）。Western blot结果显示与静态培养组比较,LSS组内PCSK9蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与LSS组比较,CN+LSS组内PCSK9蛋白表达下降,并且呈现浓度依赖性,差异具有统计学意义（P<0.05）。其中以20 μmol/L CN+LSS组PCSK9蛋白表达下降最为明显(P<0.01)。结论: CN能够抑制LSS诱导的HUVECs凋亡,其作用机制与CN下调LSS处理的HUVECs中PCSK9蛋白表达相关。     

血管紧张素-(1-7) 对血管紧张素II致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用研究

目的:观察血管紧张素-(1-7) [Ang-(1-7)] 对血管紧张素II(Ang II) 致人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用。方法:体外培养的HUVECs随机分为4 组:对照组, AngII 组, Ang-(1-7) 组, AngII+Ang-(1-7) 组。采用分光光度计测定培养的HUVECs乳酸脱氢酶(LDH) 漏出;流式细胞仪检测细胞凋亡;硝酸还原酶法和放射免疫分析技术分别测定HUVECs 上清液中一氧化氮(NO) 和内皮素-1(ET-1)的含量。结果:与对照组比较,Ang II(0.1 μmol°L^-1)显著增加HUVECs LDH 漏出(P<0.01)、ET-1 分泌(P<0.01) 和HUVECs 凋亡率(P<0.01), 显著减少NO 的含量(P<0.05);Ang-(1-7) 呈剂量依赖性抑制了Ang II 的促LDH 漏出、ET-1 分泌、增加细胞凋亡等作用, 同时明显促进HUVECs 的NO 释放;单用Ang-(1-7) 对HUVECs 无明显影响。结论:Ang-(1-7)可抑制Ang II 所致的体外培养HUVECs 损伤, 对内皮细胞具有保护作用。     

黄芪皂苷通过调控蛋白激酶R样内质网激酶途径抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞自噬的研究

目的:探讨黄芪皂苷通过调控蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）途径影响高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19细胞）自噬水平。方法:体外培养人视网膜色素上皮细胞,实验分为正常对照组（5.5 mmol/L葡萄糖）,高糖组（30 mmol/L葡萄糖）,黄芪皂苷组（30 mmol/L葡萄糖+2.5、5、10 μg/mL黄芪皂苷）。噻唑蓝比色（MTT）法检测ARPE-19细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹（Western blot）法检测自噬相关蛋白及PERK途径关键因子表达水平。添加PERK特异性抑制剂GSK2606414,Western blot检测对细胞自噬水平的影响。结果:与正常对照组比较,高糖组ARPE-19细胞活性降低,凋亡率升高,自噬相关蛋白LC3表达水平明显升高,另一自噬相关蛋白p62蛋白表达水平明显降低。PERK途径关键因子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、Perk和增强子结合蛋白的同源蛋白（CHOP）表达水平明显上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与高糖组比较,黄芪皂苷组ARPE-19细胞活性升高,凋亡率降低,LC3蛋白表达水平明显下调,p62蛋白表达水平明显上调,GRP78、Perk和CHOP蛋白水平明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。PERK特异性抑制剂GSK2606414能够进一步抑制黄芪皂苷组ARPE-19细胞LC3蛋白表达水平,上调p62蛋白表达水平,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:黄芪皂苷能够抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞自噬水平,其作用机制可能与抑制蛋白激酶R样内质网激酶途径有关。