常压室温等离子体诱变选育高产脂肪酶解脂耶氏酵母

采用常压室温等离子体(Atmospheric room temperature plasma,ARTP)对产脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株YL1进行诱变;通过三丁酸甘油酯平板法、p-NPP法以及酸碱滴定法等筛选得到高产脂肪酶的目标菌株C4,并研究其遗传稳定性。结果表明,解脂耶氏酵母菌株YL1的最佳诱变时间为60s,菌株致死率达97.45%;突变株C4的脂肪酶酶活为13.4 U/mL,较出发菌株提高了82.6%,多代培养后遗传稳定;与出发菌株相比,突变株脂肪酶可使维生素A棕榈酸酯的合成转化率提高36.9%。     

解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的研究

对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的酶反应体系进行了研究。实验发现解脂耶氏酵母全脂肪酶粉(105U/mg)在50mmol/L p H7.0 Tris-HCl(含7.5mmol/L黄胆酸钠),100mmol/L p H6.0磷酸钠缓冲液(含1000U脂肪酶)的体系中,水解产生阿魏酸的得率为2.94%。为了进一步提高脂肪酶水解效率,对解脂耶氏酵母脂肪酶中主要组分lip2脂肪酶基因进行了克隆,整合至毕赤酵母GS115基因组后发酵制取lip2脂肪酶粉(70.1U/mg),于上述酶解体系中进行水解谷维素实验。实验结果表明阿魏酸产率为2.87%。获得的lip2脂肪酶催化效率略低于全脂肪酶粉催化效率,但是获得了单一的脂肪酶基因,为进一步采取分子进化技术提高其催化能力奠定了基础。     

食品检验用解脂耶氏酵母菌标准物质制备研究

目的 为满足实验室酵母菌日常检验质量控制需求及实验室间比对,制备解脂耶氏酵母菌检验用标准物质。方法 通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱及ITS位点测序对研究用菌株进行菌种鉴定确认后,刮取适宜菌苔于保护剂中混匀后冻干,制备10_⁴ CFU/样品浓度的标准物质。参照CNAS-GL003等标准要求进行均匀性检验后,采用单因素方差分析对结果进行评价。将样品放于25 ℃和37 ℃及-20 ℃、4 ℃条件下,分别进行运输稳定性检验及储存稳定性检验。依据国家标准GB 4789.15,将研制的本标准物质加入7类食品基质共20件样品中进行检验,验证真实食品样品中适用性。组织3家实验室,对本标准物质进行协作标定。结果CMCC98025经生化鉴定为解脂耶氏酵母菌,准确度为93%;MALDI-TOF MS鉴定结果为解脂耶氏酵母,分数为2.012;ITS位点测序结果与NCBI Genbank中已有序列比对,匹配最优结果为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica(Accession number ：CP061015.1;Query Cover：95%;Ident：100%)。均匀性测试结果符合正态分布,通过单因子方差分析计算F_0.05(19,20)=2.137,F值为1.697,F＜F_0.05,符合均匀性要求。25 ℃及37 ℃培养箱中放置7天,标准物质中菌含量仍保持在10_⁴ CFU/样品,可保持稳定。标准物质于4 ℃储存28天及-20 ℃储存90天,菌含量为10_⁴ CFU/样品,复苏率均在91%以上,说明4 ℃放置较短时间及-20 ℃放置较长时间样品稳定。7类食品样品基质中加入本标准物质后进行检验,均可检出,回收率为81.3%。经三家实验室协作标定,本标准物质平均浓度为2.0～3.0×10_⁴ CFU/样品。结论 本研究制备的解脂耶氏酵母菌标准物质均匀性、稳定性、真实食品样品中应用验证及协作标定结果均符合要求,可应用于食品中解脂耶氏酵母菌定性检验,今后可作为实验室日常检验工作的阳性对照质控样品,也可作为实验室间比对样品发放,以保障日常检验工作结果可靠性,进一步提升检验机构人员的检验水平。     

解脂耶罗威亚酵母筛选方法的改良及紫外诱变选育

解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)对油脂类化合物、甘油酯有很强的代谢能力,也是工业上较为广泛应用的菌种之一.通过对油脂降解菌的筛选方法进行了改良研究,结果表明,初筛培养基pH值为6.0,维多利亚蓝B溶液加入量为1％,并且将培养基中油脂用组织捣碎机搅拌2min～3min,使培养基呈均匀的白色乳浊液,灭菌后倒出的平板对油脂降解圈的表现效果最好.为进一步提高保藏菌种的油脂降解能力,采用紫外诱变的方法对该菌种进行改良,确定最佳诱变时间为50s,经诱变筛选后将菌株的油脂降解能力从63％提高为79％,该突变菌株在对数期表现出较强的油脂降解能力,并具有良好的遗传稳定性,为生物法处理餐饮废水提供了有用的微生物资源.     

溶氧对耶氏解脂酵母油脂积累和柠檬酸分泌的影响

产油耶氏解脂酵母能将培养基中过量的碳源转化为油脂储存于细胞内并分泌大量的柠檬酸。在耶氏解脂酵母发酵过程中通过关联搅拌转速和通气量调控培养基中的溶氧含量处于5%、10%、20%、30%和不控制5种水平,来研究溶氧对其油脂积累和柠檬酸分泌的影响。结果表明,随着发酵培养基中溶氧的增加,耶氏解脂酵母细胞内油脂含量和柠檬酸分泌量均有所增加,且不控制培养基中溶氧时,细胞内油脂含量和柠檬酸产量均最高,油脂含量达到细胞干重的11.62%(w/w),柠檬酸产量达到21.0 g/L。培养基中不同的溶氧含量还会影响油脂的脂肪酸组成,高溶氧能够促进油酸含量的增加,溶氧不控制时油酸的含量最高,达到48.62%。本研究为耶氏解脂酵母产脂发酵培养过程中溶氧的控制提供了重要的实验依据。     

葡萄糖氧化酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及发酵优化

葡萄糖氧化酶(β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase;EC 1.1.3.4,简称GOD)是生物领域中至关重要的工具酶之一,被广泛应用于食品工业、饲料工业、纺织、医药等行业中。作者构建了一株重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica 1-28,分泌GOD,并进一步运用单因素实验与正交实验在摇瓶水平对其发酵培养基进行了优化。实验结果显示,最佳发酵培养基配方为:甘油20 g/L,酵母膏2.64 g/L,氯化铵2.64 g/L,无水硫酸镁0.13 g/L,磷酸二氢钾0.32 g/L,维生素B13.34×10-4g/L,初始pH值6.0。优化后GOD发酵产量达到11.0 U/mL,较初始发酵培养基GOD产量提高了72%。在此基础上进行3 L罐发酵,重组菌在甘油补料30 g/L,pH为5.0时,28℃发酵190h,发酵液酶活达到81.6 U/mL。     

解脂耶氏酵母URA3基因的敲除

构建了营养缺陷型解脂耶氏酵母菌株,使之用于遗传标记和高产香味物质γ-癸内酯.作者利用基因同源重组的方法敲除掉尿嘧啶合成酶关键基因URA3基因,用尿嘧啶营养缺陷型培养基(SD-URA)添加一定浓度的5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶筛选获得转化子.实验表明:尿嘧啶营养缺陷型菌株在含有5-FOA和尿嘧啶的培养基上生长而野生型菌株不生长,从而建立了一种快速获得营养缺陷型解脂耶氏菌株的方法.     

不同碳源培养下解脂耶氏酵母的转录组差异分析

以葡萄糖为碳源生长的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为对照组,以油酸为碳源生长的Y. lipolytica为实验组,利用Illumina高通量测序平台对两者进行转录组测序,通过多种生物信息学方法对数据进行分析处理。对照组的测序结果共得到17 923 921 clean reads;实验组的测序结果共得到22 656 852 clean reads。两个样品差异表达基因的分析显示共有536 个显著性差异表达基因,376 个基因表达上调,160 个基因表达下调。通过GO和KEGG富集分析可以了解这些差异基因参与的生物学调控。本研究为解脂酵母分子生物学的进一步研究提供了参考。     

产脂肪酶菌株的筛选、酶学特性及其接种对酸肉风味物质的影响

从食品来源菌株中筛选出6株产脂肪酶菌株,其中1株表皮葡萄球菌N30(Staphylococcus epidermidis N30)和1株解脂耶氏酵母菌C11(Yarrowia lipolyticaC11)展示出较高酶活力,分别为1.07 U/mL和0.84 U/mL。对二者酶学性质进行考察,发现二者的脂肪酶最适反应温度为50℃,最适pH值为8.0。S. epidermidis N30的最适底物为C₄酯,而Y. lipolytica C11最适底物为C₈酯。采用S. epidermidis N30或Y. lipolytica C11对酸肉接种,结果表明二者的添加均可有效提升酸肉中风味物质的生成,尤其是如丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、壬醛和1-辛烯-3-醇的含量,从而促进酸肉中果香、花香、酒香、蘑菇和脂香等香气的产生。     

不同培养基对耶氏解脂酵母合成共轭亚油酸的影响

为了提高共轭亚油酸(CLA)在耶氏解脂酵母重组菌株中的产量,选择YEA、YPD、YP2D4、YNBDO2和YNBDL25种培养基,对其进行摇瓶发酵,分析其生长状态,并利用气相色谱法测定菌体中的总脂含量及脂肪酸组成.结果表明:培养基中充足的碳源和氮源是提高菌体生物量及重组蛋白表达量的前提;在培养基中添加脂肪酸显著提高了菌体中的总脂含量和t10,c12-CLA产量;在5种培养基中,YNBDL2是最适合t10,c12-CLA合成的培养基,其培养基中t10,c12-CLA产量为185.8 mg/L,是YPD培养基中t10,c12-CLA产量的13倍.     

传统自然发酵酸肉中细菌群落多样性与风味品质分析

为探讨传统自然发酵酸肉中细菌群落多样性与风味品质的关系,采用Ion S5 XL测序平台,对4 种传统自然发酵酸肉中细菌16S rDNA V3～V4区进行高通量测序,并结合电子鼻和固相微萃取-气相色谱-质谱（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS）分析等手段揭示酸肉细菌群落结构及其风味品质的相关性。结果表明,样品获得序列数平均为110?395?条。4?种酸肉样品中总体细菌群落包含11?个门,其中厚壁菌门占绝对优势,约占总细菌群落的83.73%～98.92%,其次是变形菌门和放线菌门。主要优势菌属为乳杆菌属、魏斯氏菌属和乳球菌属。利用SPME-GC-MS从酸肉样品中检测到的挥发性物质包括酸类、醇类、醛类、酯类、酮类、萜烯类等化合物共126?种。各样品之间的菌属丰度存在一定的差异性,其菌群组成与工艺密切相关,而菌群种类和数量影响产品风味。与传统方法相比,高通量测序得到的细菌多样性信息更接近于样品微生态,能够全面解析自然发酵肉制品酸肉的细菌多样性,为传统食品的现代化改造和质量安全控制提供科学支撑。     

发酵酸肉肽的抗氧化稳定性分析

利用碱性蛋白酶酶解提取发酵酸肉肽,分析不同p H、温度、金属离子、食品原料、光照及模拟胃肠环境对酸肉肽OH自由基清除率、DPPH清除率、金属离子螯合能力及还原力的影响。在p H 3～11范围,酸肉肽抗氧化活性随p H升高,先增加后降低,当p H=7时,DPPH自由基清除率、Fe~(2+)螯合能力及还原力最高,分别为85.56%、93.21%、85.61%;在温度20～100℃范围,随温度升高,酸肉肽抗氧化活性先增加后降低,40℃时,OH自由基及DPPH自由基清除率、Fe~(2+)螯合力、还原力最高,分别为90.88%、91.64%、74.54%、72.58%;酸肉肽抗氧化活性在Cu~(2+)、Zn~(2+)离子环境中生物活性低,在K~+、Ca~(2+)离子环境生物活性保持率较高;葡萄糖及Na Cl环境对酸肉肽存在一定抑制或破坏作用;酸肉肽抗氧化活性随放置时间的延长降低,且黑暗环境更益于酸肉肽抗氧化稳定性;模拟胃肠条件下,酸肉肽抗氧化稳定性表现为胃液消化胃肠消化。综合分析,为保持发酵酸肉肽较好的抗氧化活性,酸肉肽在加工储存过程中应避免强酸强碱,避免高温及铜、锌离子接触,同时避免高糖、高Na Cl,尽量避光储存。     

贵州荔波传统酸肉发酵期间理化成分与发酵风味物质分析

针对贵州荔波传统酸肉不同发酵期理化成分和发酵风味物质变化进行动态观察与分析。结果显示:pH值呈阶段性下降趋势,10d内显著性下降(从pH7.20下降到pH4.50),10d后缓慢下降,至第45天达到最低值(pH3.60);蛋白质、脂肪含量在整个发酵期呈上升趋势,而水分含量呈下降趋势,总糖含量总体呈下降趋势,代谢产物总酸、氨基酸态氮、游离氨基酸、挥发性盐基氮的含量随发酵期的延长逐渐增加,从传统酸肉风味物质中分析出34种主要化合物,包括酸类15种、醛类11种、烷烃类1种、烯类1种、酯类3种、醇类3种,以酸味物质为主,占总组分的44%。     

酸肉发酵过程中挥发性风味物质形成的研究

采用SDE-GC-MS 分析酸肉发酵过程中风味物质的变化,以了解脂肪及蛋白质降解与酸肉风味形成的关系。结果显示酸肉挥发性成分从原料的31 种增至发酵结束时的85 种,其中,酯类、醛类和碳氢化合物从发酵开始时的7、8 种和10 种分别增至发酵结束时的23、23 种和27 种,相对含量分别从发酵开始时的24.34%、23.71% 和31.63%分别增减至发酵结束时的33.86%、38.40%和20.87%,线性相关分析显示过氧化值与酯类香气相对含量变化显著负相关(P ＜ 0.05)。发酵中形成的特征香气有桉油醇、2- 乙氧基乙基硫烷基醋酸和2- 甲氧基苯酚等,主要风味物质是2,4- 葵二烯醛和葵酸乙酯,构成了发酵酸肉特有的酯香味、酸味和清香味。推测风味的形成是通过微生物生长繁殖分泌胞外酶,导致脂肪及蛋白质降解,产生与发酵风味形成有关的醛、酮、醇、酸等物质,并发生酯化反应,形成了酸肉的特有风味。     

Yarrowia lipolytica发酵生产γ-癸内酯工艺的初步研究

目的:研究生物转化方法生产天然γ-癸内酯。方法:在单因素实验的基础上,对Yarrowia lipolytica AS2.1405菌株以蓖麻油为底物发酵生产γ-癸内酯的培养基配方进行优化。结果:在较为适宜的培养基中培养48h后,γ-癸内酯发酵产量达到0.6g/L。结论:实验结果可为γ-癸内酯发酵工艺改进提供依据。     

发酵肉制品常见微生物及其对风味的影响

介绍了发酵肉制品中常用微生物的种类、性质、作用以及常用的微生物发酵剂,探讨了微生物在发酵过程中形成的风味物质及其对肉制品风味的影响。     

发酵酸肉中降胆固醇乳酸菌的筛选、鉴定及降胆固醇作用

采用不同培养基筛选发酵酸肉中降胆固醇乳酸菌,结果从发酵酸肉中分离出18 株降胆固醇乳酸菌,其中菌株SR10降胆固醇能力最强,胆固醇降低率达33.78%,对应降胆固醇的量为68.49 μg/mL。经对筛选菌株SR10进行形态学观察、理化指标鉴定及16S rRNA分子生物学鉴定,确认该乳酸菌为消化乳杆菌;并初步研究了该消化乳杆菌SR10的降胆固醇作用机理,发现SR10降胆固醇酶主要来源于胞内,胞内酶比活力是胞外酶的8.7 倍,在降胆固醇作用中胞内酶起主要作用。     

重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇

菜油甾醇是一种具有重要生理活性的植物甾醇。为构建合成菜油甾醇的工程菌株,通过敲除解脂亚罗酵母polf菌株中麦角固醇合成基因ERG5,促进麦角-5,7,24-三烯醇的体内积累,进而表达经密码子优化的非洲爪蟾DHCR7基因,使麦角-5,7,24-三烯醇在DHCR7和polf胞内ERG4的共同催化作用下,转化成菜油甾醇,最后利用GC-MS对重组菌株的发酵产物进行检测分析。结果表明,重组菌株polf-ERG5--DHCR7+(PED)合成菜油甾醇的产量达0.485 mg/g(以细胞干重计)。重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇菌株的成功构建,为生物合成法合成植物甾醇提供了新思路。     

酸性蛋白酶对酸肉发酵过程中菌群结构和风味品质的影响

为改善酸肉的生产工艺,研究商品化酸性蛋白酶对酸肉发酵过程中菌群结构、理化特性和风味品质的影响,利用高通量测序技术分析酸肉发酵过程中细菌和真菌群落组成。结果表明,蛋白酶的添加影响了酸肉发酵过程中乳杆菌、芽孢杆菌和葡萄球菌的相对丰度,降低了真菌的丰富度,并提高了酸肉中游离氨基酸总量。气相色谱-质谱分析结果表明,蛋白酶的添加提高了成熟酸肉中醇类、酸类、酯类、酮类和醛类物质的种类和含量。相关性分析结果显示葡萄球菌属与3-羟基-2-丁酮含量呈显著正相关,芽孢杆菌属与1-辛烯-3-醇含量呈显著正相关。感官评定结果表明,蛋白酶的添加提高了酸肉的滋味、气味和总体可接受度。因此,酸性蛋白酶对酸肉的菌群结构和风味品质具有重要影响,研究结果为改善酸肉生产工艺提供了理论依据。