藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx-HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

植物乳杆菌细菌素基因plnEF的克隆与异源表达

目的:构建目的基因plnEF原核表达系统,诱导工程菌BL21-p ET28a-PL-plnEF表达目的融合蛋白并纯化,以期获得大量纯度较高的植物乳杆菌PlnEF细菌素,开发新的食品防腐剂。方法:构建含plnEF基因的重组质粒,将其转入大肠杆菌BL21中,经过IPTG诱导大量表达目标蛋白,融合蛋白PlnEF经纯化后进行分子量大小、抑菌活性等的检测。结果:重组质粒pET28a-PL-plnEF在大肠杆菌BL21中成功表达,合成PlnEF蛋白,其分子量为15.6 k Da,且该融合蛋白对大肠杆菌JM109具有良好的抑菌活性。结论:plnEF基因片段能够在原核细胞中正确表达且具有活性,本文为进一步研究开发该细菌素作为生物防腐剂奠定了基础。     

丝胶抗冻肽在大肠杆菌中的重组表达及其抗冻活性初探

为了高效制备抗冻肽,研究一种丝胶抗冻肽目的基因SerD在大肠杆菌BL21菌株中的重组表达,并分析表达产物的抗冻活性。首先合成SerD基因片段,经KpnI和XhoI双酶切后定向插入质粒载体Pet32a中,构建表达质粒Pet32a-SerD,然后电转化入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的基因表达,利用镍琼脂糖亲和层析对目的重组蛋白进行纯化,并对其进行抗冻活性分析。结果表明,最佳表达条件为重组菌在20℃诱导16 h;通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹试验(Western-Blot)鉴定重组蛋白表达成功且His-SerD融合蛋白表达的分子量在25~35 kDa之间;胞内表达His-SerD融合蛋白的大肠杆菌BL21-SerD复苏后的生长活性明显高于PBL空载菌;添加His-SerD融合蛋白可明显降低溶液中冰晶颗粒大小,具有较好的重结晶抑制效果。本文通过基因工程方法在大肠杆菌中成功构建丝胶肽抗冻肽的重组表达系统,并最终获得具有抗冷冻胁迫保护作用的His-SerD融合蛋白。     

硫氧还蛋白促进人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中高效可溶表达

为实现人胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在大肠杆菌中的高效可溶表达,获得大量具生物活性的IGF-1。应用融合PCR技术构建trx-igf1融合基因,克隆至p ET30a载体。重组载体pET30a-Trx-IGF-1转化大肠杆菌C43(DE3),并进行条件优化大量表达可溶性蛋白Trx-IGF-1。利用His标签纯化表达产物,对纯化蛋白进行Western blot与生物活性分析。构建的pET30a-Trx-IGF-1重组载体转化大肠杆菌C43(DE3)后,在30℃培养条件下1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,获得大量以可溶形式表达的融合蛋白Trx-IGF-1;采用Ni离子亲和层析,获得纯度达90%以上的融合蛋白,经Western blot检测具有IGF-1抗原活性。生物学活性检测显示,融合蛋白Trx-IGF-1能明显促进NIH3T3细胞增殖及细胞周期进展。本研究应用的载体蛋白Trx,能实现在大肠杆菌中高效可溶表达具生物活性的IGF-1,为包涵体蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达提供借鉴。     

Mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化

本研究通过应用基因工程技术,构建融合基因pET14b-Mincle的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白Mincle,并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段,将其克隆于载体pMD18-T中,并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中;重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达目的蛋白。经1mmol/LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达,利用Ni2+亲和柱进行纯化和生物膜透析复性,纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌(SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活性测定,透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性,表明获得了具有活性的蛋白,为后续研究打下基础。     

鲎素Tachyplesin Ⅰ在大肠杆菌中的重组表达及其抑菌活性

为了高效制备抗菌肽,本文将鲎素抗菌肽目的基因Tachyplesin-1(TP1)在大肠杆菌BL21中进行表达。首先构建表达质粒pET32a-TP1并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的融合蛋白表达,并利用His标签与镍柱亲和层析对融合蛋白进行纯化。纯化后的融合蛋白经羟胺裂解液切割和质谱分析后,获得单一的TP1重组蛋白,最后对其抑菌活性进行表征。结果表明,重组菌在37℃经IPTG诱导后,融合蛋白表达成功,TrxA-TP1融合蛋白的分子量在20 kDa左右。经羟胺裂解得到的重组蛋白TP1对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均具有良好抑菌活性,最小抑菌浓度分别为6和10 mg/L。本研究为鲎素抗菌肽TP1的开发应用和大量生产奠定了基础。     

重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达

目的研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的表达。方法用RT-PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因,用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因,将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体,并转染293细胞研究其表达和活性。结果成功得到重组人活性蛋白C基因,并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞获高效表达以及相关活性数据。结论通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因,并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达。     

人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都对酶有激活作用,且Mg2＋效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。     

解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)源唾液酸醛缩酶基因的异源表达及其活性研究

为发掘新型唾液酸醛缩酶,使其在大肠杆菌中得到高效表达,本研究首次从菌株Pedobacter heparinus中克隆疑似编码唾液酸醛缩酶的PhNeuLy3300基因片段,并构建可自主表达异源蛋白的组成型表达载体pRSF-EM5。在此基础上将克隆的目的基因分别导入该pRSF-EM5载体和常用的诱导型载体pET-30a,构建重组质粒pET30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300,经大肠杆菌表达系统异源表达目的蛋白,并进一步对两种重组蛋白酶进行电泳分析和活性研究。结果表明:编码唾液酸醛缩酶的基因片段全长为945 bp,共编码314个氨基酸残基;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两种重组蛋白表观分子量约为36.4 kDa,纯化后的pET30a-PhNeuLy3300重组蛋白浓度为3.29 mg/mL,证明经异源表达获得了两种重组目的蛋白酶;活性研究显示两种重组唾液酸醛缩酶均能在1 h内催化N-乙酰神经氨酸生成N-乙酰甘露糖胺,证明两种重组蛋白酶均具有较高的活性。     

鲶鱼骨酶解物抑菌性能研究

以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌3种菌为受试菌,研究了鲶鱼骨酶解物的抑菌性能,并初步探讨了鲶鱼骨酶解物抑菌作用的稳定性。结果表明,鲶鱼骨酶解物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌都有明显的抑制作用,其中对藤黄微球菌抑制作用最强,其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别是6 mg/mL和8 mg/mL,鲶鱼骨酶解物的抑菌活性具有较好的热稳定性和pH不稳定性。     

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件。方法以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件。结果最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6%,培养温度37℃,诱导表达时间5 h。蛋白表达量比优化前提高近30%,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg.protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/(mg.protein)为对照,重组酶的酶活性提高66%。结论工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高。     

大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定

利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。通过8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在77.9kD的一条蛋白质特异表达带,特异蛋白质表达量达到总蛋白质含量的8%左右。通过初步发酵,获到具有PAL活性的粗酶液裂解液,粗酶的比活力达到211.7μmol/gpro·min(3529μkat/kg),高于红酵母PAL和欧芹重组PAL表达的比活力。结果表明克隆重组的大豆PAL基因通过表达质粒pET-GMPAL在E.coli中能高效地表达为有催化功能的高活力酶。     

荸荠英提取物抑菌活性及其应用研究

为了提高荸荠的深加工附加值,本实验从荸荠加工废弃物荸荠皮中提取抑菌物质,研究其抑菌活性及其应用。结果表明,荸荠英提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用,其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,且持续性好。荸荠英提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌的抑制作用高于1%的山梨酸钾溶液,而对枯草芽孢杆菌的抑制作用与其比较接近;利用荸荠英提取物能有效防止彩色水果番茄贮藏过程中由根霉和链格孢引起的腐烂,与根霉相比,荸荠英提取物对链格孢的抑制效果更好。     

乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：构建连接乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的非抗性重组质粒。方法：以瑞士乳杆菌基因组DNA 为模板,克隆胞外蛋白水解酶基因,连接到以thyA 为选择压力的非抗性穿梭表达载体pW425et 上,构建重组质粒pW425et-R,转化入thyA 基因缺陷型E.coli X13 感受态细胞,SDS-PAGE 电泳检测显示该水解酶得到了表达。结果：成功构建了重组质粒pW425et-R,胞外蛋白水解酶基因在E.coli X13 中得到正确表达。结论：成功地表达了乳酸菌胞外蛋白水解酶基因,可为进一步制备具降血压功能基因工程乳酸菌提供参考。     

中性蛋白酶酶解羊骨产物抗菌性的研究初探

研究利用中性蛋白酶对羊骨进行酶解，采用五因素五水平正交旋转设计对羊骨进行酶解，以抗菌率为指标，对酶解条件进行优化，并对最优条件下所得产物的抗菌性进行详细对照评定。以大肠杆菌、枯草杆菌和藤黄球菌为供试菌种。结果发现，第21组酶解液（即酶浓度200U／g，底物浓度1：3，时间6h，酶解温度50℃，pH值为7．0）的抗菌性相对较强，但其抗菌性的强度相当于0．015％～0．019％亚硝酸钠溶液的抑菌力。21号酶解液对大肠杆菌、枯草杆菌和藤黄球菌在第4h～10h的生长时间范围内，表现出明显的抑制作用。     

人溶菌酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达

人溶菌酶是一种天然广谱抑菌物质,在食品和医药工业有潜在应用前景。为获得高活性的人溶菌酶制剂,采用乳酸克鲁维酵母表达系统,对经密码子优化的人溶菌酶基因(h LYZ)进行分泌表达。将人工合成h LYZ插入到乳酸克鲁维酵母表达载体p KLAC1,构建重组载体p KLAC1-h LYZ,并用电脉冲法将SacⅡ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中。通过全细胞PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌h LYZ1。工程菌可以分泌表达分子量约14 ku的目的蛋白质,与预期大小相符。摇瓶发酵培养128 h,酶活最高达到1430 U/mL。抗菌活性检测结果显示,重组人溶菌酶对溶壁微球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有较好的溶菌活性。本研究成功地在乳酸克鲁维酵母中表达了重组人溶菌酶,表达的蛋白具有较高的酶活性,试验结果为利用乳酸克鲁维酵母表达系统规模化生产重组人溶菌酶奠了基础。     

不同防腐剂对3 种模式腐败菌抑菌效果的比较

目的：研究食品防腐剂对腐败菌的抑菌效果。方法：采用微量稀释法测定不同防腐剂对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的最小抑菌质量浓度(MIC)。结果：对于藤黄微球菌(G+),抑菌效果最好的是乳酸链球菌素(Nisin)与ε- 聚赖氨酸,MIC 均为12.5μg/mL;对于枯草芽孢杆菌(G+),抑菌效果最好的是丙酸钙、丁二酮、柠檬酸、柠檬醛和D- 异抗坏血酸钠,MIC 均为6.25μg/mL;对于大肠杆菌(G －),抑菌效果最好的是过氧化氢和丁二酮,MIC 均为25μg/mL。结论：不同防腐剂对3 种模式腐败菌的抑制效果有所差异,应复配使用。     

Antibacterial activity of Bacillus amyloliquefaciens phage endolysin without holin conjugation

To characterize the enzymatic activity and antibacterial activity of endolysin encoded by a Bacillus amyloliquefaciens phage, the open reading frame encoding endolysin was amplified by PCR and cloned into the expression plasmid pET21d(+). The resultant plasmid was used to transform Escherichia coli JM109(DE3). Production of endolysin in the cytosol facilitated cell lysis without coproduction of holin, which is considered to degrade or alter the cytoplasmic membrane. The phage endolysin was overexpressed and purified. Although the specific activity of the purified phage endolysin towards lyophilized Micrococcus luteus cells was 1/11 of the activity of chicken egg white lysozymes, the endolysin showed stronger antibacterial activity towards E. coli W3110, E. coli JM109(DE3) and Pseudomonas aeruginosa PAO1 than chicken egg white lysozymes. The antibacterial activity of the endolysin towards these three bacterial strains was marked when EDTA was added to the endolysin solution.     

Analysis of essential amino acid residues for catalytic activity of glutaminase from Micrococcus luteus K-3

Structural-based mutational analysis of salt-tolerant glutaminase from Micrococcus luteus K-3 (Micrococcus glutaminase) revealed that three amino acid residues, S64, K67, and E160, were essential to a catalytic reaction. The result suggested that Micrococcus glutaminase had a possible catalytic mechanism similar to class A beta-lactamase rather than glutaminase-asparaginase from Pseudomonas 7A.