白喉类毒素的超敏感试验

<正> 接种吸精白类或含有该成分的制品,除能诱导机体产生白喉抗毒素外,尚能引起一定程度的全身与局部反应。为了解产生这些副反应的规律,我们以豚鼠为动物模型,采用迟发性超敏感试验法对其进行了研究。方法是将2.0Lf 的吸精白类或吸精白破二联(含于0.5ml 盐水中),注射于体重400～500g 白豚鼠后腿肌肉内,使其致敏。在26～28日时,于动物背部皮内注射不同激发量的普通和精制白喉类毒素,并于24和48     

精制白喉类毒素的再精制

在1994年生产中，有7批精白类纯度低于法规规定的1500Lf／mg．PN的水平。将这些低纯度的精白类再精制是十分必要的。精制白喉类毒素再精制的方法有：pope的硫酸铵分段法，肖锡岭等的中空维超滤法，以及阚毓筠等的SephadexG200分离法等。由于第3法操作复杂，收率较低，且不适用于大量生产，因此我们主要参考第1、2法。经过多次小量试验，确定精制一段用硫酸铵炭末沉淀，第二段用截留3万分子量物质的中空纤维超滤。具体的方法是：第一段先将精白类稀释至500Lf／ml，加0．5％NaHCO3以稳定溶液的pH，加26％～29％的（NH4）2SO4，0．2％～0…     

应用甲醛—赖氨酸解毒结合中空纤维超滤提高精制白喉类毒素纯度

精制白喉毒素单纯用甲醛解毒,解毒过程Lf/ml损失平均为14.81％,Lf/mg PN下降平均为13％;采用甲醛-赖氨酸解毒,解毒过程Lf/ml无损失,Lf/mg PN反而上升,平均为6.74％,纯度平均为2216Lf/mg PN。该制品经截留分子量为3万的中空纤维柱超滤后,纯度提高15.21％,平均为2540Lf/mg PN。HPLC仪分析结果表明,超滤后的特异类毒素成分由原来的78.26％增加至91.36％,非特异成分由原来的21.74％降低至8.64％。特异类毒素成分的分子量约为6.45万。     

腮腺炎疫苗与白喉、破伤风类毒素同时或分别接种的免疫应答

目的了解腮腺炎疫苗与吸附精制白喉、破伤风二联类毒素（ＤＴ）能否同时接种,为制定免疫方案 提供依据。方法用冻干流行性腮腺炎减毒活疫苗和吸附精制白、破二联类毒素同时和分别接种８～１４岁的寄宿 学生,观察其免疫应答。结果两苗同时接种与分别接种临床反应及免疫应答差异均无显著意义。结论两苗是 可以同时接种的。     

第三批吸附白喉类毒素国家标准品的制备和标定

目的建立第三批吸附白喉类毒素国家标准品,用于效价测定。方法选用白喉疫苗生产菌株(PW8,CMCC38007),经复苏传代和产毒培养后,收获白喉毒素,采用先精制后脱毒的方法获得精制白喉类毒素原液,再加入氢氧化铝吸附后分装冻干,作为备选品。按《中国药典》三部(2010版)要求对原液和冻干品进行检定。以WHO国际标准品(07/216)和中国国家标准品(002)为标准,采用小鼠Vero细胞法在3个实验室进行协作标定。结果该批标准品的各项检测指标均符合国家标准品的规定;经协作标定,获得的20个效价单位标定结果合并统计后几何均值为289.3 IU/ml,95%可信区间为276.0~303.2;同时用WHO国际标准品(07/216)和中国国家标准品(002)进行标定比较,两者差异无统计学意义(P0.05);标准品效价稳定性考核结果证明,我国白喉类毒素国家标准品在保存期内效价稳定。结论所制备的标准品各项指标均符合要求,其效价定为289.3 IU/支,可作为第三批吸附白喉类毒素国家标准品用于效价测定。     

小鼠-Vero细胞法测定白喉类毒素抗体试验条件的优化

目的优化小鼠-Vero细胞法测定白喉类毒素抗体的试验条件。方法用含吸附白喉类毒素的制品免疫NIH小鼠,35d后眼眶采血,分离血清,对用小鼠-Vero细胞法测定白喉类毒素抗体的试验条件进行优化。结果确定了小鼠-Vero细胞法测定白喉类毒素抗体的最佳试验条件。结论优化试验条件的小鼠-Vero细胞测定白喉类毒素抗体的方法,能客观准确地评价白喉类毒素免疫保护效力,且具有特异、灵敏、重复性好的特点。     

不同氢氧化铝含量的吸附白破二联疫苗的吸附度及免疫效果

按《中国生物制品规程》,应用精白类、精破类和Ａｌ（ＯＨ）３胶体溶液各３批,分别配制成不同ＡＩ（ＯＨ）３含量（１、２和３ｍｇ／ｍｌ）的吸附白破二联各３批（每批分别含精白类４０Ｌｆ／ｍｌ,精破类２０Ｌｆ／ｍｌ）,并分别进行吸附度测定和免疫力试验。结果不同ＡＩ（ＯＨ）３含量的二联吸附度均为１００％,免疫效果,白喉的活存率分别为８０％、９３％和８０％（均为３批平均值）;破伤风的抗毒素单位分别为２．７、３．１和２．７ＩＵ／ｍｌ（均为３批平均值）。表明吸附精制白破二联疫苗中ＡＩ（ＯＨ）３含量在一定范围内,免…     

吸附精制白喉—破伤风二联类毒素在控制白喉暴发流行中的作用

<正> 我县已有17年无白喉病例的报告。于1989年9月下旬～10月下旬在石门乡发生了白喉的暴发流行,历时31天。应用长春生研所生产的吸附精制白喉—破伤风二联类毒素(下简称 DT)做大面积应急预防接种后,有效地控制了白喉的发病及流行。现将结果报告如下:     

用无细胞百日咳抗原配制的吸附精制百白破制剂的特性和人群反应及血清学效果

用50L发酵罐培养百日咳菌,经硫酸铵盐析法提取保护性抗原,戊二醛解毒后,与白喉、破伤风类毒素及Al(OH)_3配合制成的吸附精制百白破制剂(APDT),质量符合规程要求。给3～5月龄婴幼儿接种后全身和局部副反应很低,与现行吸附百白破制剂(WPDT)有非常显著性差异。免后血清中抗-PT和抗-FHA抗体均有显著增长,与WPDT制剂组相比,APDT的抗-PT和抗-FHA抗体增长更为显著。APDT免后抗白喉、抗破伤风抗体滴度均超过保护水平。本制剂的质量及免疫效果均达到了国外同类产品水平。     

保存于不同温度和时间的吸附精制百白破混合制剂的稳定性

吸附精制百白破混合制剂（DTPa）系由戊二醛解毒的百日咳毒素和丝状血凝素，通过蔗糖密度梯度离心去除内毒素，再与白喉和破伤风类毒素以及AI（OH）a按一定比例混合制成。经对接种人群反应和血清学效果观察，证实了其良好的安全性和免疫原性。为了解该制品的稳定性，我们对于保存于不同温度和时间的DTPa进行了毒性和效力稳定性的研究。试验所用的901、902、903、glls、gll6、9117、CT08、CT09、CT10、CTll、CT12、96O12、96013和96O14批制剂均按吸附精制百白破制检暂定规程生产和检定。于2～SC保存1、2、4年和37℃保存2、4、13周…     

精制白喉标准毒素及精制锡克试验毒素的制备与检定

采用纯度为2000Lf/mgPN以上的精制白喉毒素,加到甘油明胶缓冲液中,制成约1000MLD/ml的精制白喉标准毒素。放置4℃保存10年,其MLD/Lf仅下降13.6％,证明稳定性良好;而原制白喉标准毒素在同样条件下MLD/Lf竟下降94.6％,稳定性很差,其放置的前3年,MLD/Lf呈急剧直线下降,后7年则呈缓慢下降。用精制白喉标准毒素共生产精制锡克试验毒素10批,经检定,MRD/ml和MLD/ml皆符合我国规程要求;结合力,7批符合英国药典规定,另3批经20％稀释亦能达到上述要求。原制锡克试验毒素的结合力一般为精制的2～5倍。     

应用皮内多点攻毒法检测吸附精制白喉类毒素效价

将待检吸白类与参考标准品免疫动物后进行皮内攻毒,记录得分结果进行量反应平行线分析,其可靠性测验结果表明,剂间与回归项变异皆十分显著;偏离平行项、二次曲线、反二次曲线项以及试品间项变异皆不显著。这说明3批待检吸白类与参考标准品的剂量反应回归,是平行直线关系。所检定的3批吸白类效价分别为55.47、56.74和47.06IU/0.5ml,皆超过了WHO规程规定的30IU/0.5 ml的水平。以上事实说明,WHO所推荐的皮内多点攻毒法检测吸白类效价,方法是可靠的和敏感的。     

应用戊二醛对百日咳抗原进行解毒的研究

本文报道应用戊二醛对百日咳保护性抗原解毒,并研究解毒条件与毒性及免疫原性的关系。在百日咳保护性抗原或无细胞百日咳菌苗的制造中,应用0.05%戊二醛(GA)于20℃作用4～6小时,再加入0.15～0.2%赖氨酸继续作用2小时,可以得到最佳解毒效果。用于制造无细胞百日咳菌苗符合菌苗检定要求,经37℃存放1个月后未见毒性逆转现象发生。     

无细胞百日咳疫苗中活性PT的保护作用

目的 比较经基因工程方法脱毒的无细胞百日咳疫苗(APV)中不同含量活性PT的保护作用。方法 用小鼠保护性试验(AMPT)评价不同含量活性PT疫苗样品的百日咳效力,组织胺致敏试验(HST)检测不同含量PT样品中PT活性。结果 含5ng活性PT的疫苗与不含PT的疫苗效力差异无显著意义;含50ng活性PT疫苗与不含和含5ng活性PT的疫苗效力差异有显著意义。用HST肛温测定法可以检测到含50ng活性PT的样品中PT活性。结论 AMPT适用于高度脱毒或基因工程脱毒的APV的效力检定,HST肛温测定法可以证实APV中PT的活性。     

Diphtheria toxin receptor binding domain substitution with interleukin-2: genetic construction and properties of a diphtheria toxin-related interleukin-2 fusion protein

We have genetically replaced the diphtheria toxin receptor bindingdomain with a synthetic gene encoding interleukin-2 (IL-2) anda translational stop signal. The diphtheria toxin-related T-cellgrowth factor fusion gene encodes a 70 586-d polypeptide, pro-BL-2-toxin.The mature form of IL-2- toxin has a deduced mol. wt of 68 086and is shown to be exported to the periplasmic compartment ofEscherichia coli (pABI508), and contain immunologic determinantsintrinsic to both its diphtheria toxin and IL-2 components.EL-2-toxin has been purified from periplasmic extracts of recombinantstrains of E.coli (pABI508) by immunoaffinity chromatographyusing immobilized anti-IL-2. The purified chimeric toxin isshown to selectively inhibit protein synthesis in IL-2 receptorbearing targeted cells, whereas cell lines which do not expressthe IL-2 receptor are resistant to IL-2-toxin action.     

无细胞百日咳疫苗效力国家参考品的建立

采用罐培养百日咳CS菌株,培养物经硫酸铵两段盐析、浸提后,再经蔗糖密度梯度离心,收集以FHA．PT为主的百日咳菌保护性抗原,经福尔马林解毒,制备成原液。该原液按照中国和日本的生物制品规程检定合格后,加入保护剂,稀释至18μgPN／ml,分装冻干制备成无细胞百日咳疫苗效力参考品。以JNIH3和JNIH－6参考品为标准,按照日本规程的小鼠脑腔攻击法标定其效力单位。根据14次效力试验所得的结果和日本NIH标定的结果,该批疫苗效力国家参考品的效力单位定为15PIU／ml。     

A群脑膜炎球菌多糖-白喉毒素无毒变异体CRM197结合物的制备及其初步评价

目的制备A群膜炎球菌多糖(Group A meningococcal polysaccharide,GAMP)-白喉毒素无毒变异体CRM197(Cross-reactive material 197)结合物,并分析其理化性质及免疫学特性。方法白喉棒状杆菌C7 M1菌株经发酵培养表达CRM197,表达产物经DEAE-4FF层析柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。用溴化氰(CNBr)活化GAMP,己二酰肼(ADH)为连接剂,在碳二亚胺(EDAC)催化下将GAMP与CRM197共价结合,制备GAMP-ADH-CRM197结合物,经Sepharose 4FF层析柱纯化后,进行各项生化检测,采用免疫双扩散检测结合物的抗原性,将结合物皮下注射ICR小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP的抗体滴度,分析其免疫原性。结果发酵培养20 h时,菌液上清中的CRM197蛋白表达量最高;CRM197以分泌形式表达,纯化后纯度达95%以上,可与白喉类毒素单抗发生特异性反应;GAMP-ADH-CRM197结合物各项生化指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求,与A群流脑诊断血清形成明显的沉淀线,结合物诱生的多糖特异性抗体滴度显著高于多糖组和混合物组。结论成功制备了GAMP-ADH-CRM197结合物,其具有良好的抗原性和免疫原性,为以CRM197为蛋白载体制备脑膜炎球菌结合疫苗奠定了基础。     

旋转填料床吹脱脲醛树脂中游离甲醛的气提气体的研究

基于板材行业中使用的脲醛树脂胶大部分存在游离甲醛超标的问题，提出了新型强化传递过程技术-超重力技术。为了考察空气和水蒸汽两种气提气体通过旋转填料床对脲醛树脂中游离甲醛的脱除效率，在相同的实验条件下，以空气和水蒸汽为气提气体分别进行脲醛树脂脱除甲醛的实验。结果显示水蒸汽对甲醛的脱除率最高为60．1％，空气为58％。说明水蒸汽对甲醛的脱除率略高于空气，并且随进气量的增大脱除率呈现先增大后减小的趋势。对此结果作了理论分析，并指出了两种气体作为气提气体各自的特点。     

白喉毒素无毒变异体CRM_(197)的表达及其载体作用

目的表达白喉毒素无毒变异体CRM197,并考察其载体作用。方法利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达CRM197,用金属镍离子亲和层析纯化;以重组CRM197为蛋白载体,在EDAC的作用下,与活化的A群脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP)结合,制备GAMP-rCRM197结合物,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法测定血清中A群脑膜炎球菌多糖特异性IgG抗体,并分析其免疫原性。结果重组CRM197在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的25%左右;Western blot证明重组CRM197具有良好的反应原性;各针接种后,结合物诱生的多糖特异性IgG水平均显著高于GAMP组和GAMP+rCRM197混合物组,具有较强的免疫原性;多次接种产生了免疫增强效应,重组CRM197具有载体蛋白的作用。结论已在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组CRM197,以纯化的重组CRM197作为载体制备的GAMP-rCRM197结合物具有良好的免疫原性,为以重组CRM197为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础。