干酪乳杆菌LC2W最优电转化条件的建立

目的建立干酪乳杆菌LC2W电转化的最优条件。方法研究了不同质粒、细胞壁弱化剂浓度、电场强度、复苏时间以及质粒浓度对电转效率的影响,通过单因素轮换法进行了逐一优化。结果经过对乳杆菌感受态制备及电转过程中各因素的考察,得到最佳的参数条件为:添加1%甘氨酸作为细胞壁弱化剂制成感受态细胞,电场强度为10 kV/cm进行高压电击后,复苏3 h,质粒浓度为200 ng/μL时,能够达到最高的电转效率为1.25×106 CFU/μg DNA。结论经优化后,获得了较高的转化水平,可用于指导多种乳杆菌的高效电转,并且为下一步的LC2W菌株改造和基因功能探究奠定了基础。     

干酪乳杆菌LC2W最优电转化条件的建立

目的 建立干酪乳杆菌LC2W电转化的最优条件 。方法 研究了不同质粒、细胞壁弱化剂浓度、电场强度、复苏时间以及质粒浓度对电转效率的影响,通过单因素轮换法进行了逐一优化。结果 经过对乳杆菌感受态制备及电转过程中各因素的考察,得到最佳的参数条件为：添加1 %甘氨酸作为细胞壁弱化剂制成感受态细胞,电场强度为10 kV/cm进行高压电击后,复苏3 h,质粒浓度为200 ng/μL时,能够达到最高的电转效率为1.25×106 CFU/μg DNA。结论 经优化后,获得了较高的转化水平,可用于指导多种乳杆菌的高效电转,并且为下一步的LC2W菌株改造和基因功能探究奠定了基础。     

克雷伯氏肺炎杆菌电击转化条件的优化

针对克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)TUAC01的电击转化方法进行了研究。主要考察了培养基EDTA的浓度、细胞的生长状态、感受态细胞的密度、电击电压、质粒浓度等参数对转化效率的影响,建立了一种适合K.pneumoniae TUAC01的电击转化方法。结果:K.pneumoniae TUAC01培养基中添加EDTA至终浓度0.7mmol/L;当细胞生长至OD600为0.7时收集菌体,制作感受态细胞;制作的感受态细胞浓度OD600大于30时,使用2mm的电转杯在2kV的电压下转化,转化效率达到最大值,达到8.58×105cfu/μg DNA。     

利用组成型表达载体pMG36e电转化德式乳杆菌保加利亚亚种的研究

以典型的乳酸菌组成型表达质粒pMG36e为载体,德式乳杆菌保加利亚亚种为受体.采用电转化方法研究受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,以提高电转化效率.结果表明:选择含2.5%甘氨酸的SMRS培养基培养受体细胞至对数中期,收获制成感受态细胞,在电场强度12 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF条件下电击转化,以含20 mmol/L MgCl2、CaCl2的SMRS培养基复苏培养2 h,涂板筛选得到较高的电转化效率.特别是采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率提高30倍以上,达到6.3×104cfu/μg DNA.本研究结果为进一步构建乳酸菌组成型高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株提供试验依据.     

植物乳杆菌G63电转化方法的优化

为获得植物乳杆菌G63高效的电转化方法,本研究从细胞生长状态、细胞弱化剂质量浓度、洗涤液、质粒添加量和电击参数等方面对菌株G63的电转化效率进行优化。结果表明：取菌株G63对数生长中期的细胞制备感受态,以1 g/100 mL甘氨酸作为细胞弱化剂,分别用1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL聚乙二醇1000洗涤细胞,并用30 g/100 mL聚乙二醇1000作为电击液,加入20 μg穿梭质粒,在1.5 kV和400 Ω条件下进行电击,可以获得最高的电转化效率,转化效率达到1.18×103 CFU/μg DNA,满足后续遗传学实验要求。     

电转化法制备高转化效率的E.coli感受态细胞研究

为了制备高转化效率的E.coli TG1和E.coli DH5α感受态细胞,采用电转化方法探索E.coli生长对数期的不同生长阶段、质粒DNA含量、电场强度对E.coli转化效率的影响.研究结果表明40 μL菌液中加1.0 ng pUC19 DNA,用间隙0.2 am电击杯时转化效率最高,E.coli TG1有1个电转化效率峰值,即A600为0.665时,转化效率达1.7×109cfu/μg pUC19 DNA;E.coli DH5α有2个转化效率峰值,即A600为0.443和0.810时,转化效率均为3.0×109cfu/μg pUC19DNA.研究结果表明,在相同情况下E.coli DH5α的转化效率高于E.coliTG1,利用本实验确定的参数可制备出高转化效率的电转化感受态细胞.     

嗜碱芽孢杆菌电转化方法的优化

优化了嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)TCCC11263的电转化条件,电转化条件包括细胞生长状态、电击场强、电击缓冲液组成、质粒DNA浓度.建立了一种适用于B.alcalophilus TCCC11263的电转化体系.结果为:B alcalophilus TCCC11263培养至OD600为1.0时,电转化效率最高,DNA的转化子数达0.14×103个转化子/μg:用含0.5mol梨醇、0.5mol甘露醇、10%甘油的电击缓冲液洗涤细胞,在场强21kV/cm、电阻200Ω,电容25μF的电击条件下,加入0.7μg质粒DNA,电转化效率达到1.5×103个转化子/μg DNA.     

微胶囊化对植物乳杆菌在高盐干酪中存活率的影响

为了提高益生菌在高盐干酪中的存活能力,以高盐白卤(white-brined)干酪为例,研究微胶囊化的植物乳杆菌在高盐干酪中的活性变化。通过挤压法制作微胶囊,将其添加至白卤干酪中,观察微胶囊的结构及其在干酪中的分布,并对益生菌在白卤干酪中的存活能力及模拟胃肠道中的活性进行评价。结果表明:微胶囊为球形,表面光滑,其平均直径100~140μm,菌体于微胶囊内部,而微胶囊在干酪中分布均匀;干酪贮存期间,包埋的益生菌数量下降,显著低于未包埋的益生菌(P0.05),分别由(12.30±0.20)lg(cfu/g)降至(9.27±0.06)lg(cfu/g),(11.27±0.12)lg(cfu/g)降至(6.60±0.06)lg(cfu/g)。经模拟胃肠道处理,微胶囊活菌数降至7.47 lg(cfu/g)和7.83 lg(cfu/g),较未包埋分别提高了1.4 lg(cfu/g)(P0.05)和1.03 lg(cfu/g)(P0.05)。质构分析及感官评价表明,含包埋与未包埋植物乳杆菌的干酪组无显著差异(P0.05)。以上结果表明,微胶囊化益生菌菌数较未微胶囊提高了2.6 lg(cfu/g),有效提高了高盐干酪中益生菌的活性。     

乳杆菌电转化条件的优化

乳杆菌的遗传转化是限制对其遗传操作的关键因素之一.本实验用广宿主质粒pHY300PLK电转化植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B0080,并优化了转化条件.系统地考察了细胞的生长时期、生长培养基组分、质粒浓度、电击时电场强度、复苏培养基组分等因素对转化效率的影响.选择含5.13%甘氨酸和0.54mol/L蔗糖的MRS培养基制备乳杆菌受体细胞,加入500ng质粒DNA,在电场强度7.41kV/cm电击转化,以含有0.3mol/L蔗糖的MRS培养基复苏培养,获得最佳转化率为3.6×104CFU/μg DNA,比使用初始方法得到的转化率提高了40倍.采用优化后条件,同样实现了pHY300PLK、pBBR1MCS-5对L.amylovoru s B0112和L.acidophilus B0068的高效转化,为进一步对这些菌株进行基因工程改造奠定了有利的方法学基础.     

利用响应面法优化发酵乳杆菌AR497电转化条件

以1株能有效改善小鼠肠炎的发酵乳杆菌AR497为研究对象,在Plackett-Burman试验的基础上选取甘氨酸质量浓度、OD_(600)、电场强度和山梨醇浓度为自变量,电转化效率为响应值,利用Box-Behnken响应面法优化其电转化条件。最优条件为:电场强度15 kV/cm,山梨醇浓度0.6 mol/L,OD_(600)0.2,甘氨酸质量浓度26 g/L。在此条件下,电转化效率高达2.78×10~5 CFU/μg DNA,比优化前提高了22倍,实现了发酵乳杆菌AR497的高效遗传转化,为后续对其进行遗传改造和解析抗炎机制奠定基础。     

基于原生质体法保加利亚乳杆菌电转化条件的研究

目的:研究不同因素对保加利亚乳杆菌原生质体法电转化效率的影响,通过研究电转化的最适条件,以提高电转化的效率。方法:以保加利亚乳杆菌为受体菌株,大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,通过原生质体电转化的方法研究溶菌酶浓度、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成对电转化效率的影响。结果:用SMM在37℃下制备溶菌酶(30 mg/mL)对细胞进行酶解,直至通过显微镜发现约60%的原生质体形成。用1μL质量浓度为1.2μg/μL的质粒pMG36e,在电场强度7.5 kV/cm,电阻200Ω,电容25μF的条件进行电击转化,以含有0.5 mol/L蔗糖和20 mmol/L的MgCl_2、CaCl_2且无吐温80的MRS再生培养基复苏培养2.5 h,并以含红霉素的MRS平板筛选,获得1.42×10~5CFU/μgDNA的电转化效率。结论:本研究实现了保加利亚乳杆菌的高效遗传转化,并为遗传育种提供了技术支持。     

鼠李糖乳杆菌电转化条件的研究

目的:研究不同因素对鼠李糖乳杆菌电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,提高电转化效率。方法:以鼠李糖乳杆菌05-28为受体菌株,大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒p MG36e为载体,通过原生质体电转化的方法研究了质粒浓度、电击缓冲液、电转化参数、复苏培养基组成及复苏培养时间对电转化效率的影响。结果:利用1μL质量浓度为1μg/μL的质粒p MG36e,在电场强度8 k V/cm,电阻200Ω,电容25μF的条件下进行电击转化,以含有0.5 mol/L蔗糖和20 mmol/L的MgCl_2、CaCl_2且无吐温80的MRS再生培养基复苏培养2.5 h,并采用添加红霉素的筛选培养基,获得1.66×105CFU/μg DNA的电转化效率。结论 :实现了鼠李糖乳杆菌的高效遗传转化,为遗传育种提供了技术支持。     

明串珠菌电转化的优化

为了构建食品级基因工程受体菌,课题对明串珠菌的电转化条件进行了优化.以大肠杆菌-明串珠菌穿梭质粒pCW4为载体,以明串珠菌为受体,文章优化了细胞壁处理方式、电击参数、复苏时间等与电转化相关的因素.结果表明:用氨苄浓度0.7μg/mL的MRS培养基培养明串珠菌至OD600为0.5左右,以PBS作缓冲液,收获制成感受态细胞,与1μg DNA混合,在电场强度12 kV/cm、电阻200 Ω、电容25μF下电击转化,以含80 mmol/L MgCl2的MRS培养基复苏培养3h,得到最高的转化效率为1.75×105 cfu/μg DNA.     

乳酸菌抗诱变致癌物质研究

不少对健康有害的物质,如苯酚、甲苯酚、吲哚、次级胆汁酸和雌性激素等在体内长期积累会诱发结肠癌的发生.本文考察了戊糖乳杆菌Ind1和Ind3清除苯酚、对甲酚和吲哚这些诱变物质的能力,结果显示:只有浓度大于150μg/mL的苯酚、对甲酚和吲哚对菌株生长显示略有影响,影响与物质及其浓度和菌株有关,但是经37℃厌氧培养144h后,三个菌株的活菌数仍然在10~6cfu/mL以上,说明戊糖乳杆菌对肠道中有害的酚类物质有较高的耐受性.在浓度为5μg/mL以及50μg/mL的苯酚和对甲酚培养基中,戊糖乳杆菌Ind1和Ind3在37℃分别培养24h和144h后,苯酚和对甲酚含量明显被减少,其浓度在0.95～1.93μg/mL之间,对甲酚浓度在0.45～1.141μg/mL之间,3株乳杆菌活菌数从10~9cfu/mL降至10°cfu/mL,诱变因子的吸附量随着细胞培养时间的延长而降低,表明乳杆菌细胞对突变因子有较好的黏附或降解作用. ,三个菌株的活菌数仍然在10~6cfu/mL以上,说明戊糖乳杆菌对肠道中有害的酚类物质有较高的耐受性.在浓度为5μg/mL以及50μg/mL的苯酚和对甲酚培养基中,戊糖乳杆菌Ind1和I d3在37℃分别培养24h和144h后,苯酚和对甲酚含量明显被减少,其浓度在0.95～1.93μg/mL之间,对甲酚浓度在0.45～1.141μg/mL之间,3株乳杆菌活菌数从10~9cfu/mL降至10°cfu/mL,诱变因子的吸附量随着细胞培养时间的延长而降低,表明乳杆菌细胞对突变因子有较好的黏附或降解作用. ,三个菌株的活菌数仍然在10~6cfu/mL以上,说明戊糖乳杆菌对     

干酪乳杆菌对柑橘汁发酵的工艺研究

研究了干酪乳杆菌发酵柑橘汁的发酵过程.接入柑橘汁后的0～10h内干酪乳杆菌处于迟滞期;第10h开始发酵进入对数期,并在第52h结束,发酵终点的活菌数为1.31×109 cfu/mL;发酵液pH值从起点的6.11降至终点的3.69;发酵液最高总酸达到1.48 g/100mL.进一步研究了干酪乳杆菌营养源的优化,结果表明添...     

液体乳和乳饮料中β-内酰胺酶检测方法的研究

利用杯碟法检测液体乳和乳饮料中β-内酰胺酶,确定了检测方法的各项参数。研究表明,选择LB营养琼脂作为上层培养基,用量为5 mL,以藤黄微球菌作为指示菌,菌悬液浓度达到1×109cfu/mL,青霉素G的使用浓度为0.5μg/mL时,0.05 IU/mL的β-内酰胺酶可以分解0.5μg/mL青霉素G,此方法的最低检测限为0.005 IU/mL,重复性较好,准确度高。     

采用实时荧光定量PCR法同时定性定量检测发酵乳中多种益生菌

为快速、准确地对益生菌发酵乳中的干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌进行定性、定量检测,通过设计干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌种属特异性引物,建立了双重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。结果表明,所建标准曲线方程线性关系良好,相关系数R²均达到0.99以上。对市售产品随机抽样检测发现:样品1、样品2未添加干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌。样品3中检出干酪乳杆菌(1.39±0.25)×10⁹copies/mL,未检出罗伊氏乳杆菌。自制益生菌发酵乳检出干酪乳杆菌(3.7±0.35)×10⁹copies/mL、罗伊氏乳杆菌(4.8±0.26)×10⁹copies/mL,检测结果均与所知的益生菌种类及数量信息相符。结果表明,上述建立的实时荧光定量PCR方法能够同时对益生菌发酵乳中的干酪乳杆菌及罗伊氏乳杆菌进行快速、准确地定性、定量检测,克服了平板培养法和流式细胞术的局限,具有一定的优势和应用前景。     

同源片段长度对副干酪乳杆菌同源重组频率的影响

目的:探索同源片段大小与副干酪乳杆菌同源重组率之间的关系。方法:分别构建以氨苄青霉素和四环素抗性标记基因为遗传转化筛选标记的,用于敲除prc K,prc R基因的4个同源重组质粒p2NIL-KA(625 bp,650bp),pUC18-KT(1 350 bp,1 350 bp),p2NIL-RT(433 bp,474 bp),pUC18-RT(1 350 bp,1 350 bp),并分别电转化于副干酪乳杆菌HD1.7感受态细胞中,检测筛选同源重组转化子,计算发生同源重组的频率。结果:成功构建同源重组质粒,p2NIL-KA(625 bp,650 bp),pUC18-KT(1 350 bp,1 350 bp),p2NIL-RT(433 bp,474 bp),pUC18-RT(1 350 bp,1 350 bp)同源重组频率分别为0,1.85%,0,1.78%。结论:当同源片段长度为1 350 bp或更长时,可与副干酪乳杆菌染色体进行同源重组。     

传统发酵牦牛乳中2株高产胞外多糖乳酸菌在模拟消化道中耐受力的研究

从传统发酵牦牛发酵乳中分离出的2株高产胞外多糖乳酸菌,为了研究其在模拟消化道中耐受力,对2株乳酸菌(植物乳杆菌、干酪乳杆菌)分别在人工胃液、人工肠液、人工胆汁和高盐4个模拟人工胃肠道消化环境中进行培养,测其耐受力以及对Caco﹣2细胞的黏附能力。结果表明:植物乳杆菌和干酪乳杆菌在人工胃液中作用3 h的存活率随pH值的增大而增加。在pH4.5时,植物乳杆菌的存活率达到53.63%,干酪乳杆菌的存活率达到50.83%;在人工肠液中作用4h,植物乳杆菌的存活率达到了59.58%,干酪乳杆菌的存活率达到了51.42%;在胆盐环境中培养24 h后的植物乳杆菌和干酪乳杆菌活菌数随牛胆盐质量浓度的增加而降低,活菌数均保持在108cfu/m L以上;在高盐环境中培养24 h后的活菌数随盐质量浓度的增加而降低,活菌数均在108 cfu/mL以上;并且2株乳酸菌的黏附能力也很强,植物乳杆菌可以达到16.83%、干酪乳杆菌可以达到14.86%。结论:植物乳杆菌和干酪乳杆菌均能通过胃进入肠道并保持活力,而且能在肠道很好地定植,为植物乳杆菌和干酪乳杆菌作为益生菌应用在食品中提供了理论基础。     

嗜热链球菌的电转化条件

为了获得高产活性共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的嗜热链球菌并开发功能性发酵乳,研究甘氨酸浓度、菌体生物量、电极缓冲液、电压、质粒浓度对电转化效率的影响。结果表明,嗜热链球菌菌体生长与甘氨酸质量浓度呈现负相关,质量浓度为10 g/L时电转化效率最高。电转化效率的影响呈现先上升后下降的趋势;随着菌体生物量、转化电压和质粒浓度的增加,OD600=0. 8、电压1. 8 k V、质粒质量浓度为1. 0 g/L时电转化效率最高;电转缓冲液bufferⅡ(0.5 mol/L蔗糖,1 mmol/L柠檬酸铵; p H 6.0)表现出较好的转化效率。优化嗜热链球菌的电转化条件,提高其转化率,为乳酸菌的高效转化提供一定的理论基础,并为生产具有CLA生理功能的发酵乳提供新的思路。