非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

毕赤酵母工程菌表达猪β-干扰素

根据毕赤酵母密码子偏爱,人工合成了猪β-干扰素(PoIFN-β)基因,构建了重组载体pPICZA-PoIFN-β。重组载体经Sac I线性化后,电击转入毕赤酵母GS115,对在含博莱霉素(Zeocin)平板上生长的转化子进行鉴定,得到分泌表达猪β-干扰素的毕赤酵母基因工程菌株GS115/pPICZA-PoIFN-β。以1%甲醇诱导GS115/pPICZA-PoIFN-β表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,工程菌株实现了猪β-干扰素的高效分泌表达,表达产物为相对分子质量22ku和26ku的混合物,表达蛋白量约为80mg/L。     

通用型毕赤酵母高密度培养策略的网络共享技术

甲醇营养型毕赤酵母是近年来广泛应用的一种外源蛋白表达系统。本课题组在前期研究中构建了一系列能够满足绝大多数毕赤酵母高密度发酵过程工艺控制需求的通用型控制策略:用于细胞培养期的改良型DO-Stat甘油流加策略;用于甲醇诱导期的“甲醇浓度受限-溶解氧浓度充足”诱导控制策略;用于甲醇诱导期的“甲醇浓度充足-溶氧浓度受限”诱导控制策略。然而,这些控制策略的推广需要极高的时间和人力成本。为此,本文开发了基于Django框架搭建的服务器程序,以实现通用型毕赤酵母高密度培养策略的网络共享,并依靠前期开发完成的客户端程序实现控制软件包与不同发酵设备之间的对接。在甲醇利用快型(methanol utilization plusphenotype,Mut+)毕赤酵母表达人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子突变体融合蛋白(HSA-GCSF m)和甲醇利用慢型(methanol utilization slow phenotype,Mut S)毕赤酵母表达人源溶菌酶(hLYZ)实验中分别验证了以上通用型控制策略的网络共享功能。结果表明,Mut+型毕赤酵母诱导60 h后HSA-GCSF m的质量浓度达到532 mg/L;Mut S型毕赤酵母诱导69 h后总酶活达到84032.0 U/mg,对应的比酶活力为52884.0 U/mg;HSA-GCSF m产量和hLYZ活力均达到较优水平。     

毕赤酵母高效表达重组β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导方法研究

将甘草酸生物转化合成GAMG已成为国内外医药和食品行业研究的热点。该文在前期构建毕赤酵母(pichia pastoris)工程菌GS115-GUS的基础上,对重组毕赤酵母工程菌发酵条件进行了研究。通过单因素及正交试验建立工程菌最佳表达β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导产酶方法:重组毕赤酵母GS115-GUS菌株在液体YPD培养基中活化24 h后,接种到BMGY中富集菌体,OD600达到6.0时,按照1∶1(V/V)的接种比率接入到pH为6.0的BMMY培养基中,加入1.5%诱导剂甲醇诱导产酶,且每隔24 h添加一次。该诱导产酶条件简单、易行、科学、合理,毕赤酵母高效表达GAMG的酶活高达1.97×103 U/mL,研究结果达到预期目标,为进一步研究重组酵母工程菌产β-葡萄糖醛酸苷酶的发酵水平、β-葡萄糖醛酸苷酶生物催化甘草酸制备GAMG以及工业化生产奠定基础。     

大豆β-淀粉酶基因在毕赤酵母中的高密度发酵表达

大豆β-淀粉酶在麦芽糖浆生产上具有应用优势。该研究应用毕赤酵母表达系统异源表达大豆β-淀粉酶,并对重组酶的酶学性质进行了分析,结果显示,其酶学性质没有改变。为了增强重组β-淀粉酶的表达,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导的毕赤酵母表达策略,10 L发酵罐发酵表达的重组β-淀粉酶酶活力为310 U/mL,比单一甲醇诱导提高了36%。研究结果表明,发酵条件优化对提高异源β-淀粉酶在毕赤酵母中的表达有重要参考价值。     

康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在毕赤酵母中的表达研究

在毕赤酵母中表达康氏木霉(Trichoderma koningii)纤维素酶基因cbhI。提取经诱导的康氏木霉mRNA,通过反转录及PCR反应扩增纤维素酶cbhI基因cDNA。将cbhI基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,采用电激法将经SacⅠ线性化的重组质粒pPICZαA-cbhI转化毕赤酵母GS115,MD及G418抗性平板筛选cbhI基因高拷贝转化子,并用PCR鉴定转化子。BMMY培养基中加入0.5%甲醇对毕赤酵母进行纤维素酶CBHI诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示,表达的重组蛋白相对分子质量约67 kD,pNPC酶活为24.1 U/L,酶蛋白量为0.22 mg/mL,表明,康氏木霉cbhI可以在毕赤酵母中表达,并具有较高活性。     

重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的研究

探讨重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的特性,以期能够通过基因工程和发酵工程技术大规模的生产活性重组藻蓝蛋白。先用甘油作碳源培养重组巴斯德毕赤酵母工程菌,达到一定生物量后,再用甲醇诱导外源重组藻蓝蛋白基因的表达,并测定了甘油浓度、细胞干重、细胞光密度和藻蓝蛋白含量的变化。结果表明:所获得的细胞干重最高达41.93g/L,细胞光密度最高为182.77,藻蓝蛋白的最高产量为61.20mg/L,分泌到胞外的藻蓝蛋白的最高产量为24.32mg/L。该研究为实现藻蓝蛋白的产业化生产奠定了良好的基础。     

甲醇毕赤酵母Pichia methanolica的高效电转化方法

采用电穿孔的方法对甲醇毕赤酵母进行外源DNA的转化。通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pMETA-Lip对甲醇毕赤酵母PMAD16的高效电转化方法。结果表明,当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、质粒DNA浓度为30μg/mL、采用0.2cm电转杯、电压为600 V时,转化率达到最大值,为57个转化子/μg质粒DNA。经抽样鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。为外源基因在甲醇毕赤酵母中的表达奠定了基础。     

低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响

毕赤酵母表达系统是近年发展较为突出的表达系统之一.大量研究表明,低温诱导在毕赤酵母发酵过程中对促进细胞物质及能量代谢,提高胞内醇氧化酶活力及能量水平,降低细胞死亡率及蛋白酶作用有明显影响;此外,外源蛋白表达过程中的聚集与降解作用也与诱导温度有关.该文从诱导温度角度对重组毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展进行了综述.     

短小芽孢杆菌碱性β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

以毕赤酵母密码子为基准,对短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因密码子进行优化,设计合成全基因序列,构建表达载体转入毕赤酵母中。结果表明,短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因已成功转入酵母菌中并分泌表达,诱导培养72h发酵液的酶活力可达25.39U/mL。重组酶最适反应温度45℃,最适pH 9.0,重组酶的K_m值1.26mmol/L,V_(max)为32.15μmol/(min·mg)。重组β-葡萄糖苷酶对大豆苷水解活性相对活力是pNPG的248%,转糖苷活性催化50%底物葡萄糖合成龙胆二糖,达34.25g/L。     

“低甲醇浓度-高溶解氧浓度”策略诱导毕赤酵母高效表达HSA-GCSF~m及其转录组学机理分析

甲醇/山梨醇共混诱导毕赤酵母(Mut~+,GS115)表达人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子突变体融合蛋白(HSA-GCSFm)的过程中,甲醇消耗与O_2消耗相互偶联,难以将甲醇浓度和溶解氧浓度(DO)同时维持在高水平。该文研究探讨了"低甲醇浓度-高DO"和"高甲醇浓度-低DO"诱导策略下HSA-GCSFm的表达性能。结果表明,"低甲醇浓度-高DO"诱导策略策略下的HSA-GCSF~m浓度达到587.5 mg/L,而"高甲醇浓度-低DO"诱导策略下的HSA-GCSF~m浓度仅达到106 mg/L。利用转录组学技术分析上述2种诱导策略引起HSA-GCSF~m表达水平差异的分子机制,结果表明:"低甲醇浓度-高DO"条件下甲醇代谢途径、TCA循环和过氧化物酶体相关的部分基因上调,而与蛋白水解作用相关的部分基因下调,表明该条件下甲醇和山梨醇的代谢活性更高,细胞抗高DO冲击的能力更强,错误折叠的蛋白减少。     

基于自联想神经网络的毕赤酵母发酵过程两阶段故障诊断

在毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素-2融合蛋白(IL-2-HSA)过程中,诱导期甲醇浓度和pH值直接影响了IL-2-HSA表达量的高低和发酵过程的稳定。为了准确有效的控制这两个参数,本论文基于毕赤酵母诱导期的生理学特性和过程参数特征,提出了基于自联想神经网络的毕赤酵母表达IL-2-HSA过程的诱导期两阶段故障诊断。研究结果表明该诊断系统能够在线快速准确地诊断出毕赤酵母诱导期的各种故障。当系统提示出现故障时,离线分析,对比最优的pH值和甲醇质量浓度变化曲线,确定故障类型,采取相应措施。     

痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的异源表达 及其静息细胞催化合成共轭亚油酸

来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（PAI）是一种能够通过单酶催化,生成共轭亚油酸（t10,c12-CLA）的亚油酸异构酶。为实现PAI的高效表达,以pPink为表达载体,毕赤酵母（PichiaPinkTM Strain2）为宿主菌,构建毕赤酵母重组菌株（Pichia-pPink-His-opai）,实现了PAI在毕赤酵母中的异源表达。对毕赤酵母重组菌进行初步筛选获得蛋白表达量最高的转化子,通过单因素实验优化毕赤酵母重组菌的诱导条件。毕赤酵母重组菌最佳诱导条件为：诱导时间24 h,诱导剂甲醇体积分数2%。在最佳诱导条件下,将毕赤酵母重组菌制成静息细胞催化剂催化合成t10,c12-CLA。在28 ℃、200 r/min、亚油酸质量浓度4 g/L、反应时间6 h条件下,t10,c12-CLA产量为2.12 g/L,转化率可达53%。     

外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义。该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述,主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制,旨在提高外源蛋白表达量。     

阶段控温提高透明质酸酶在毕赤酵母中的表达

透明质酸酶(Hyalurondiase,HAase)是一种具有医药作用的水解酶,为了提高HAase在重组毕赤酵母中的分泌表达量,对重组毕赤酵母诱导阶段的温度进行了优化。研究发现,降低诱导温度可以提高HAase的产量,其中两阶段控制温度诱导策略效果最为显著。诱导阶段0~60 h温度控制在25℃,60~96 h温度控制在22℃,HAase酶活最高为1.18×106U/m L,是诱导温度为30℃时(4.53×105 U/m L)的2.6倍。此外,采用两阶段控制温度诱导策略有利于细胞活性的提高和AOX1启动子的表达。两阶段控制温度诱导策略还可以应用到其他酵母表型中,为毕赤酵母高效表达外源蛋白质提供一种新思路。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115中的异源表达

目的构建毕赤酵母基因工程菌,以实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。方法人工合成朱黄青霉HI-4的α-1,6-葡聚糖酶基因ZHdex,克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电转入毕赤酵母GS115。甲醇诱导目的蛋白表达。结果成功在毕赤酵母GS115中对ZHdex基因进行表达,SDS-PAGE表明重组毕赤酵母在66×103附近有目的蛋白表达,与理论值一致。在摇瓶水平,甲醇诱导培养120 h后,α-1,6-葡聚糖酶的最高酶活达28.79 U/mL,蛋白质浓度为0.56 mg/mL。结论获得一株重组毕赤酵母GS115-ZHdex,其产物具备α-1,6-葡聚糖酶活性,成功地实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。     

抗克伦特罗单链抗体在毕赤酵母GS115中的表达

构建表达抗克伦特罗单链抗体(CBL scFv)的毕赤酵母菌株,筛选高拷贝转化子并诱导CBL scFv在毕赤酵母中的分泌表达。将构建的含有CBL scFv基因的重组真核表达载体pPICZαA-CBL经BstX I酶切线性化后,利用电转化方法转化毕赤酵母菌GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性平板筛选高拷贝转化子,以甲醇诱导蛋白表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定及ELISA活性分析。结果显示,通过筛选出的重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为41kDa的蛋白,该蛋白可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合,且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为5.1ng/mL。经检测,重组抗体表达量为0.095g/L。这说明分泌表达CBL scFv的毕赤酵母菌株构建成功,为后期CBL scFv发酵与制备奠定了基础。     

重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制与生理分析的研究进展

毕赤酵母是近年来应用广泛、极受青睐的一种外源蛋白表达系统。除了构建高效、稳定的毕赤酵母生产菌株外,研究不同发酵控制条件下,细胞的生理和代谢状态变化,为毕赤酵母细胞提供最优的生长和环境条件并综合考虑发酵成本是成功实现外源蛋白规模化、商业化生产的保障。本文从培养基组分、外界环境条件、细胞比生长速率、生长期甘油流加策略和诱导期甲醇流加策略等方面阐述了发酵过程对外源蛋白表达的影响,并进一步从细胞生理和代谢层面深入讨论了不同发酵过程控制条件的影响机制。     

抗菌肽DCD-1L在毕赤酵母中的表达及其条件优化

本文将抗菌肽DCD-1L在毕赤酵母SMD1168中表达并优化其表达条件。利用重叠延伸PCR法获得DCD-1L基因并将其重组到质粒pPICZα-A中;将重组质粒pPICZ-A—DCD-1L转化毕赤酵母蛋白酶缺陷株SMD1168并诱导表达;通过抑菌圈试验确定其最适表达时间、温度、pH值和甲醇诱导量。结果表明：最适表达时间为48h,温度为28℃,pH值为6,甲醇诱导量为终浓度0.5％。     

耐热赖氨酸氨肽酶毕赤酵母表达及培养条件优化

为实现耐热耐氨酸氨肽酶的异源表达,通过PCR扩增技术从Pseudomonas aeruginosa NJ-814基因组中克隆获得耐热的赖氨肽酶基因(PLAP),构建重组载体p PIC9K-PLAP,并最终实现在毕赤酵母GS115中的分泌表达。对重组毕赤酵母进行初步筛选,单因素实验优化获得重组毕赤酵母最佳诱导条件如下:诱导培养基初始pH为5.0、甲醇质量浓度1.5 g/dL、诱导温度28℃、装液量25 mL/250 mL、Co~(2+)浓度50μmol/mL、山梨醇添加量9 g/L。在最优条件下,氨肽酶酶活提高了5.2倍,比酶活2.74 U/mg。实验结果表明:PLAP基因已成功转入毕赤酵母GS115并获得表达。