PCR-RFLP方法检测和鉴别五种李斯特菌

目的 建立快速检测和鉴别单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌和格氏李斯特菌等常见李斯特菌的方法。方法 采用PCR-RFLP技术,首先通过引物“Lis1A-Lis1B”对李斯特菌属iap基因进行扩增,扩增产物大小约1.4 kb,然后用限制性内切酶DdeⅠ对PCR产物进行酶切,电泳观察具有种间特异性的酶切谱带进行鉴别。结果 上述5种李斯特菌的PCR扩增产物经内切酶DdeⅠ消化后,得到片段大小不同的,具有种间差异的特异性酶切图谱。结论 本实验建立的PCR-RFLP方法可以用于上述5种常见李斯特菌的快速检测和鉴定。     

应用核酸层析技术快速检测奶粉中阪崎肠杆菌的研究

结合PCP与胶体金免疫层析试纸条技术建立了核酸层析检测技术用于奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测.该技术根据寡-1,6-葡萄糖苷酶基因设计引物,并分别标记生物素和地高辛,通过试纸条上肉眼可见的红色条带对扩增结果进行判断.通过11株阪崎肠杆菌及27株常见致病菌的检测结果说明其特异性强,阪崎肠杆菌纯菌培养检测灵敏度达到103 mL-1,人工污染样品检测限达到0.08 g-1,检测奶粉样品时与传统方法(GB/T 4789.40-2010)相比,无显著性差异(x2=0,P＞0.05).该方法灵敏度高、快速、特异性强,可以很好地应用于奶粉以及其他食品中阪崎肠杆菌的检测与鉴定.     

单增李斯特菌鞭毛蛋白提取方法的研究

本实验对单增李斯特菌鞭毛蛋白提取方法进行研究,分别在23℃和37℃的条件下对单增李斯特菌(血清型IVb)进行扩增培养,发现23℃下单增李斯特菌产鞭毛的能力更强。运用酸解法处理单增李斯特菌后,分别通过超速离心法和硫酸铵沉淀法对鞭毛蛋白进行纯化,SDS-PAGE 电泳以及电镜的实验结果表明,超速离心较硫酸铵沉淀法简便、耗时短、纯度高、产量高,适用于单增李斯特菌鞭毛蛋白的提取。     

基于高分辨率溶解曲线分析鉴别食品中的3种李斯特氏菌

本研究利用高分辨率熔解曲线的方法,以iap基因为靶标新设计一对引物同时鉴别单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌,其余14种常见食源性病原微生物扩增为阴性结果,单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌的检出限为10个拷贝,英诺克李斯特氏菌的检测限为50个拷贝。本研究对78份样品进行HRM-realtimePCR法、GB4789.30-2016和SN/T1870-2016(荧光PCR法)的检测,并对3种方法的检测结果进行统计学分析。结果显示:HRM法和国标方法、HRM法和荧光PCR法的检测结果之间存在统计学差异,国标方法和荧光PCR法检测结果之间无统计学差异。本研究建立的基于HRM-real time PCR法检测3种李斯特氏菌的方法快速高效、特异性好、成本低,适用于食品中李斯特氏菌的日常检测和监管。     

一种快速鉴定单增李斯特菌的方法

通过单增李斯特菌的生化特性对李斯特菌进行鉴定,并根据单增李斯特菌的actA基因序列,以及其他李斯特菌的特异性靶序列设计引物,用PCR技术快速鉴定单增李斯特菌.结果表明,生化实验时间较长且误差较大,而通过PCR能成功扩增出827bp的特征性条带,同时用CTAB/NaCI法和热裂解法分别提取基因组后进行PCR和电泳,结果两种方法都可以很好的扩增出特征性条带,而热裂解法由于更简便快速,实验确定了热裂解法是一种快速有效的鉴定单增李斯特菌的方法.     

改良LAMP检测鸡肉中单增李斯特氏菌的研究

本研究建立一种改良环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测鸡肉中单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L. monocytogenes)的方法。针对单增李斯特氏菌的溶血素基因(hlyA)设计LAMP引物,对单增李斯特氏菌进行特异性检测,通过荧光曲线和肉眼观察荧光颜色来判定检测结果。试验结果表明:改良LAMP方法检测单增李斯特氏菌具有良好的特异性,7株单增李斯特氏菌呈阳性结果,24株非单增李斯特氏菌呈阴性结果。与聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法相比,改良LAMP方法具有灵敏度高(5.4×100 fg/μL)、检出限低(3.9×100 CFU/g)的特点,均是PCR结果的100倍。对66份鸡肉样品进行检测,得到改良LAMP方法的敏感性为100%,特异性为98.41%,符合率为98.48%。综上所述,改良LAMP方法能够快速、准确的检测单增李斯特氏菌,具有很好的应用前景。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度(LAMP)检测方法的建立

建立单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度LAMP检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌hly A基因设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增方法 (LAMP)建立单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法。建立的LAMP方法具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,单核细胞增生李斯特氏菌为LAMP阳性,其他菌株均为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的单核细胞增生李斯特氏菌的检测下限为32 CFU/m L,可在60 min内完成扩增反应。用建立的LAMP方法对160份不同食品进行检测,共检出5份LAMP阳性样本,与传统培养方法结果一致。该方法与传统方法相比,可节省大量时间,且对试验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性。     

PMA-LAMP检测单增李斯特活菌方法的建立

建立一种将荧光染料Propidium Monoazide(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的检测方法,用于高效检测活的单核细胞增多性李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)。利用PMA抑制单增李斯特死菌后进行LAMP扩增实验、并研究了PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的灵敏度,同时与PMA-PCR方法灵敏度进行比较。结果表明,50μmol/L的PMA处理浓度为5×108cfu/mL单增李斯特死菌,能够完全抑制LAMP扩增。PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的检出限为4.9×101cfu/mL,其灵敏度是PMA-PCR方法的10倍。该方法可以作为一种快速检测单增李斯特活菌的新技术。     

链置换恒温扩增快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

目的开发单核细胞增生李斯特氏菌快速、简便、准确的链置换恒温扩增(strand displacement amplification,SDA)检测方法。方法根据单核增生李斯特菌特异性基因prfA基因片段,设计链置换扩增特异性引物,建立单核细胞增生李斯特菌SDA快速检测方法,同时对设计的引物的特异性和灵敏度进行研究。结果所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA扩增方法灵敏度达到了7.0×10~2 CFU/mL,检验技术可以特异性地扩增单核增生李斯特菌。结论本试验所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA检验技术具有快速、简便、特异性强的特点,具有在进出口实验室推广应用前景。     

肉中4种致病菌的PCR快速检测方法的建立

目的:建立一种能同时检测肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和单核增生李斯特菌的多重PCR检测方法。方法:根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)、沙门氏菌的侵袭蛋白基因(invA)、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原基因(ipaH)和单核细胞增生性李斯特菌的内化素基因(inlA)设计引物,通过优化好的反应体系进行多重聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因。结果:特异性实验结果表明4种菌均能在相应位置扩增出特异性条带。对污染4种菌的猪肉进行检测,确定出金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检出限是102CFU/mL,志贺氏菌和单核增生李斯特菌的检出限是101CFU/mL。结论:本实验建立的多重PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏,适用于肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门菌和单核增生李斯特菌的快速检测。     

肉中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法建立

目的:建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法:采用聚合酶链式反应技术(PCR)特异性扩增单核细胞增生李斯特菌内化素基因(ivlA),并评价该方法的特异性与敏感性。结果:在445bp处出现inlA基因的目的片断,只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增,其他菌种扩增均呈阴性;该方法可以检测到DNA的检测限。结论:PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便;为肉中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测方法

为建立食品中单核细胞增生性李斯特氏菌 (单增李斯特氏菌 )的快速、敏感、特异的PCR检测方法 ,选取hlyA基因作为靶序列设计一对引物 ,用该引物对 6 3株从国内食品中分离的李斯特氏菌 (进行传统方法验证 )和 2 0株非李斯特氏菌进行PCR扩增 ,并用此方法对人工污染食品进行检测 ,扩增片段表现出极好的单增李斯特氏菌种特异性 ,人工污染的生肉、冷冻虾仁、卷心菜的检出限为 39cfu g ,为食品中单增李斯特氏菌的快速、敏感并且特异的检测方法。     

食品中单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金 试纸条方法的建立

目的 建立食品中单核增生李斯特氏菌快速检测PCR-免疫胶体金试纸条法。方法 通过设计特异性引物建立单增李斯特氏菌检测PCR方法并使用免疫胶体金技术建立PCR产物快速检测试纸条; 用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度与敏感度。使用新建方法对市售肉制品和乳制品中单核增生李斯特氏菌进行检测, 验证该方法在食品检测中的可行性。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度, 敏感度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。采集乳品样品131份, 阳性样品1份, 检出率1.53%; 肉制品224份, 阳性样品4份, 检测率1.79%。结论 建立的单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好, 敏感度高, 适用于食品中单增李斯特氏菌的检测。     

PCR技术在食源性致病微生物快速检测中的应用

PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是一种体外快速扩增基因或DNA序列的方法。食源性致病微生物是影响食品质量和安全的主要因素之一,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义。PCR技术以其自身的灵敏度高、特异性强、速度快等优点作为食源性致病微生物检测的关键技术在食品中得到广泛的应用。本文简要介绍PCR技术的基本原理,及其在几种食源性致病微生物如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏杆菌、致病性大肠杆菌及其他一些有害微生物检测中的应用,并分析了PCR技术在食源性致病菌检测的实际应用中存在的一些问题及对此项技术的展望,这将有力促进我们今后更好地研究应用PCR技术检测食品中食源性致病微生物。     

单核增生李斯特氏菌近红外快检方法建立与应用

目的建立一种近红外荧光免疫法快速检测单增李斯特氏菌的方法。方法采用近红外荧光染料Dylight800标记单增李斯特菌单克隆抗体,结合免疫侧向流技术制备单增李斯特菌快速检测试纸条。结果整个实验过程仅需45 min,对食品中单增李斯特氏菌最低检测限为500 CFU/mL,与其他5种食源性致病菌均无交叉反应。特异性为89.47%,敏感性为100%。采用近红外荧光免疫层析法和传统方法对30份食品进行检测,结果发现2种方法符合性达93.3%。结论所研制的单增李斯特菌的近红外快检试纸条具有特异性、敏感性较高的特点,适用于食品样本中单增李斯特菌的即时检测。     

A PCR method based on 16S rRNA sequence for simultaneous detection of the genus Listeria and the species Listeria monocytogenes in food products

The genus Listeria comprises six closely related species, of which only Listeria monocytogenes is a human pathogen. The rapid and sensitive detection of L. monocytogenes is important in the food industry as well as in medical diagnosis. In this study, a PCR-based method for the rapid, specific, and sensitive detection of L. monocytogenes in food products was developed. The PCR is based on DNA sequences and primer pairs that are found within the 16S subunit of the rRNA gene and are specific to the Listeria genus and to L. monocytogenes within the Listeria genus. The primers for the Listeria genus and for L. monocytogenes were used in the same reaction mix for their simultaneous detection. In addition, a pair of bacterial primers universal to any bacterial DNA at the 16S subunit of the rRNA gene were developed as a positive control. For the detection of Listeria and L. monocytogenes in food products, the method includes selective enrichment for Listeria followed by DNA extraction and a specific PCR reaction. The method detects 1 to 5 CFU in a 25-g sample in < or = 24 h. It can be easily incorporated into the routine screening of diverse food products and readily adapted for clinical use.     

冻虾类海产品中3种致病菌的多重PCR快速检测技术的建立

建立快速检测冻虾类海产品中沙门氏菌(Salmonella typli)、副溶血性弧菌(Vibrio parahae-molyticus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重PCR方法。根据3种致病菌的靶基因,分别设计了3对引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了三重PCR检测虾类海产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌的方法,实现了对这3种致病菌的同时检测。该方法操作简单,检测周期短,具有灵敏度高、特异性强等优点,能够快速地实现对海产品中多种致病菌的诊断和监控。     

应用基因芯片技术检测肉及肉制品中5种致病菌

建立一种运用多重聚合酶链式反应(PCR)结合基因芯片技术检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌5种食源性致病菌的快速、准确、灵敏的方法。分别选取编码大肠埃希氏菌的slt基因、沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、志贺氏菌ipaH基因和单核细胞增生李斯特菌inlA基因,并以细菌16S rDNA基因作为阳性对照,设计引物和探针,进行多重PCR扩增,产物与含特异性探针的芯片杂交。结果表明：该基因芯片可同时特异性地检测5种致病菌,多重PCR检测灵敏度为20pg,而DNA芯片检测灵敏度可达2pg;用所制备的基因芯片检测实际肉及肉制品样品,准确率高于传统培养法。所建立的基因芯片检测方法特异性好、灵敏度高,可为食源性致病菌的检测提供理想手段。     

鱼翅类食品中鲨鱼成分PCR鉴定方法研究

本文针对鱼翅中的鲨鱼成分进行检测鉴定开发了一种快速灵敏的PCR检测方法,可检测鱼翅类食品中是否存在鲨鱼成分。根据鲨鱼线粒体的细胞色素亚基I基因序列设计了鲨鱼特异性引物,扩增长度为228 bp;为了评价方法的特异性,将设计的引物分别针对22份鱼翅样品DNA和37种其它种类DNA进行PCR检测,结果显示,只在鲨鱼鱼翅中能检测出特异的228 bp条带,其它37种物种中均无条带检出。为了评价方法的灵敏度,将鱼翅DNA中掺入了不同比例土豆DNA的样品采用本方法进行了PCR分析,显示方法可检测灵敏度为0.1%(m/m)。随机抽取45份不同类型的鱼翅样品,检测出22份鲨鱼翅均含鲨鱼成分,而21份仿鱼翅均不含鲨鱼成分而含有植物成分。该样品前处理方法、DNA提取方法以及PCR检测方法可广泛应用于食品中鲨鱼成分检测鉴定。     

3种致病菌多重PCR检测体系的建立及应用

金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogen,LM)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,BC)是食品中重要的致病菌,建立其多重PCR的快速检测体系,对开发食源性致病微生物快速检测试剂盒具有重要意义。根据SA的nuc基因、LM的hly基因和BC的hemolysin基因,设计合成3对特异性引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证。在此基础上建立了3种致病菌的多重PCR检测体系,并应用于食品检测中,同时以国标法进行对比验证。结果表明,建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高,检测灵敏度可达到1 cfu/mL,整个检测时间在16 h以内,具有较大的应用价值,可广泛应用于食品卫生检测以及临床检验等领域。