Alcalase蛋白酶酶解高温豆粕制备水溶性大豆多肽

以氮溶指数为指标,应用Alcalase蛋白酶酶促降解高温豆粕,以获得高得率的水溶性大豆肽。酶促降解的优化实验结果表明:在加酶量1750U/g、底物浓度4%(w/w)、温度60℃、pH9.0的条件下酶促降解3h所得到的水解产物其氮溶指数达到了62.97%,比水解前提高了47.87%;酶解前后大豆蛋白的SDS-PAGE图谱表明:Alcalase蛋白酶可以催化大豆蛋白迅速地降解,水解1h后,7S蛋白的α-亚基,α’-亚基,β-亚基以及11S的酸性亚基已经完全消失,水解3h后,11S的碱性亚基也基本消失,且大多数的肽类分子量在20ku以下;与以大豆分离蛋白为原料制备的多肽相比,以高温豆粕为原料制备的多肽苦味值较低。     

Actinomucor elegans、Aspegillus oryzae和Rhizopus oligosporus产蛋白酶条件及蛋白酶性质的比较

比较了腐乳生产菌株Actinomucor elegans、豆酱和酱油生产菌株Aspegillus oryzae以及天培生产菌株Rhizopus oligosporus产生蛋白酶的条件和所产蛋白酶的性质。结果表明,不同的菌株产酶条件及蛋白酶的性质有较大的差异:少孢根霉主要产生酸性蛋白酶,在pH2.5-4.0的酸性介质中、32℃条件下培养时产酶能力较强,所分泌的蛋白酶系在pH5.0时酶活力最高,在pH5.0附近最稳定;米曲霉可以产生酸性、中性及碱性蛋白酶,所产生的蛋白酶活力显著高于少孢根霉和毛霉,米曲霉在酸性条件下产酸性蛋白酶能力强,在中性条件下产中性蛋白酶能力强,在碱性条件下产碱性蛋白酶能力强,在28-32℃时产酶能力强,所分泌的蛋白酶系在pH5.0-9.0的广泛范围内有很强的活力,在pH6.0-8.0的范围内稳定性强;毛霉可以产生酸性、中性及碱性蛋白酶,但酶活力明显低于米曲霉,毛霉在中性偏酸性(pH5.5)的介质中产酸性蛋白酶的能力较强,但介质的酸碱度对毛霉产中性及碱性蛋白酶没有影响,在28℃时产酸性、中性和碱性蛋白酶的能力都比较强,毛霉所分泌的蛋白酶系在pH5.0-9.0的广泛pH范围内有活力,在pH5.0-6.0时酶活力最高,在pH5.0-7.0时稳定强。     

蛋白酶对大豆分离蛋白的降解模式研究

采用十二烷基酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法，分析了几种商品蛋白酶（包括枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和细菌碱性蛋白酶）对大豆分离蛋白（SPI）的降解模式。结果表明，大豆球蛋白酸性亚基的Ax多肽链最容易被水解，所有的酶对其均有作用，而碱性亚基和大豆伴球蛋白的B亚基最难被水解。木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白的水解最迅速、彻底，由于大豆蛋白中含有胰蛋白酶抑制因子，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对大豆蛋白水解能力较差。     

梨形毛霉蛋白酶在大豆多肽制备中的应用

本文研究了腐乳生产菌种梨形毛霉所产蛋白酶对大豆分离蛋白的降解条件,并分析了酶解产物的疏水性、分子量分布及氨基酸组成。结果表明该蛋白酶酶促降解大豆分离蛋白的最佳条件是温度45℃、反应时间5h、pH6.0、酶用量750U;在此条件下制备的大豆肽经质谱检测其分子量在1000D左右,完全符合大豆肽产品的要求;经品尝,该产品无任何苦涩味,色泽淡黄,无需脱盐处理,可直接调配成酸性蛋白肽饮料。     

Rhizopus oryzae产酸性蛋白酶条件及其酶学性质研究

本文以少孢根霉(Rhizopus oligosporus)为对照研究了豆豉中的一个分离菌株米根霉(Rhizopus oryzae)产生酸性蛋白酶的条件及所产蛋白酶的性质,结果表明这个菌株的产酶条件和蛋白酶的性质与少孢根霉相比有相似性但也存在一些差异:米根霉在水分含量57%~59%、pH2.5~3.0的酸性介质中、28~31℃下培养36h时产酸性蛋白酶能力最强,所分泌的蛋白酶系在pH4.0和pH6.0附近有最强的催化活性,在pH3.0~6.0的范围内有较好的稳定性,催化反应的最适作用温度为50℃,它的温度稳定性很差,在50℃保温30min已完全失活;少孢根霉在水分含量52%~55%、pH2.5~3.0的酸性介质中、31℃下培养48h时产酸性蛋白酶能力最强,在35℃条件下培养36h也能产生较高的酶活力,少孢根霉分泌的蛋白酶系在pH3.0和pH6.0附近有最强的催化活性,在pH4.0～6.0范围内很稳定,催化反应的最适作用温度可达55～60℃,但它的温度稳定性较差,在50℃保温30min,酶活力损失达到90%,保温120min酶几乎完全失活。     

梨形毛霉蛋白酶在大豆多须制备中的应用

本文研究了腐乳生产菌种梨形毛霉所产蛋白酶对大豆分离蛋白的降解条件,并分析了酶解产物的疏水性、分子量分布及氨基酸组成。结果表明该蛋白酶酶促降解大豆分离蛋白的最佳条件是：温度45℃、反应时间5h、pH6．0、酶用量750U;在此条件下制备的大豆须经质谱检测其分子量在1000D左右,完全符合大豆肽产品的要求;经品尝,该产品无任何苦涩味,色泽淡黄,无需脱盐处理,可直接调配成酸性蛋白肽饮料。     

细菌碱性蛋白酶促大豆分离蛋白聚集

研究了大豆分离蛋白(SPI)的细菌碱性蛋白酶水解产物的聚集行为。采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效分子排阻色谱分析了细菌碱性蛋白酶对SPI的降解模式,结果显示,降解产物大部分为分子质量小于6.5kDa的小分子量组分,反应过程有不明聚集物生成。浊度分析表明,此聚集物可能由小分子的降解产物组成。在较高的蛋白质浓度下,蛋白酶甚至可以催化SPI形成弹性凝胶。     

毛霉蛋白酶的制备及催化特性的研究

该文研究了毛霉蛋白酶的催化特性以及影响其活力的一些因素,包括温度、pH值以及金属离子等。结果表明,毛霉蛋白酶有2个较为合适的作用pH值,分别为pH7.5和pH10.0,在60℃有最大催化活力;在pH6.0和40℃以下毛霉蛋白酶有很好的稳定性。SPI水解试验表明,毛霉蛋白酶是一种适于水解大豆蛋白的酶种,在大豆多肽制备方面有较好的前景。     

毛霉蛋白酶特性研究及在大豆肽生产中的应用

通过对毛霉蛋白酶活力的测定研究了毛霉蛋白酶的特性。研究表明,毛霉在培养的第5d～6d为旺盛期,毛霉蛋白酶的最适反应pH值为4.0～6.0,且在pH4.0～6.0时稳定性较好;毛霉蛋白酶的最适反应温度为45℃～55℃,50℃时酶活力最大,且在40℃以下热稳定性较好。1.0%NaCl、1.0%CaCl2、1.0%MnSO4和1.0%MgSO4对蛋白酶有激活作用,1.0%KCl、1.0%ZnSO4和1.0%CuSO4则对蛋白酶有不同程度的抑制作用。用毛霉所产的蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解所得的大豆肽具有较好的质量品质。     

蛋白酶水解大豆分离蛋白的分子水平表征

采用两种蛋白酶(胃蛋白酶和碱性蛋白酶)对大豆分离蛋白进行水解,水解结束调节pH至4.8,离心分离得到酸可溶蛋白和酸不可溶蛋白.考察不同的蛋白酶、水解时间、温度以及未添加蛋白酶的情况下,酸不可溶蛋白所占比例,并采用SE-HPLC和SDS-PAGE对这些酶解物进行了分子水平的表征.结果发现:胃蛋白酶选择性地水解大豆球蛋白(11S),在pH 2.0、37℃条件下水解6h,酸不可溶蛋白所占比例为51.14％,其相对分子质量大于10 kDa的部分占到50％以上.水解温度对碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的影响较大,在pH 8.0、60℃条件下水解1h获得的大豆分离蛋白碱性蛋白酶酶解物的相对分子质量主要分布在20 kDa以下.不同蛋白酶水解大豆分离蛋白,其水解进程存在显著差异,即使是采用同一种蛋白酶进行水解,不同的水解条件下得到的酶解物分子结构也大不相同.     

Proteolysis characteristics of Actinomucor elegans and Rhizopus oligosporus extracellular proteases under acidic conditions

Enzymatic hydrolysis of soybean protein isolate by the extracellular proteases from Actinomucor elegans and Rhizopus oligosporus at pH 3.0, 3.5, 5.0, 5.5 and 6.0 was investigated. The activity of the A. elegans protease is lower than that of R. oligosporus, but both proteases exhibit considerable degradation of soybean protein at pH 5.5 and 6.0. The water‐soluble protein content and the degree of hydrolysis of the hydrolysates are increased significantly, and bitterness values are very low. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS‐PAGE) reveals that these proteases have different cutting sites on peptide polymers. At pH 5.5, there is a lower content of total free amino acids (39.20 mg per 100 mL; 62.68% hydrophobic amino acids) in the R. oligosporus protease hydrolysate. In conclusion, treatment with R. oligosporus protease at pH 5.5 achieves efficient degradation of soybean protein, suggesting a promising industrial process for making bitterless protein hydrolysates.     

大豆分离蛋白与寡糖静电相互作用及复合物乳化性的分析

以大豆分离蛋白（soybean protein isolate,SPI）和寡糖（棉子糖和水苏糖）为原料制备复合溶液,通过调节pH值（3.0～10.0）研究SPI-寡糖形成复合体系的相行为、微观结构,确定形成可溶性静电复合物的条件及其对蛋白质溶解性、乳化性的影响。Zeta电位、激光共聚焦显微镜观测和浊度测定的结果显示,在酸性条件下,SPI与寡糖通过静电相互作用形成复合物,且等电点与SPI相比向酸性偏移;内源荧光光谱扫描发现SPI-寡糖复合物的荧光强度低于SPI,且静电相互作用越强荧光强度降低越明显。当pH?6.0时,SPI-寡糖较大程度形成可溶性静电复合物,此时复合物的功能性质较SPI有所改善,SPI-水苏糖和SPI-棉子糖的乳化性与SPI相比分别提高了50.66%和39.69%。     

高水解度大豆寡肽专用复合酶的配方优化

为提高大豆分离蛋白(SPI)的水解度,实现深度酶解,生产低分子质量寡肽,比较不同蛋白酶与不同配方的复合酶对SPI的水解能力,并采用响应面法对复合酶的组成进行优化。结果表明：不同蛋白酶对SPI的酶解能力不同,其中以碱性蛋白酶的水解度寡肽收率最高。多酶复合水解可以提高SPI的水解度与寡肽收率,其中以同时加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶进行水解时水解度最高。由此3种酶组成的复合酶的最佳组成是碱性蛋白酶39.6%、风味蛋白酶25.4%、中性蛋白酶35.0%,最适用量为SPI干质量的3%。以此复合酶在55℃、SPI质量浓度10g/100mL、自然pH值的条件下酶解6h,SPI的水解度可达27.2%,寡肽收率高达83%。     

超声波-酶法联合改性提高酸性条件下大豆分离蛋白的乳化性能

为了研究超声波联合酶技术提高大豆分离蛋白(Soybean Protein Isolated,SPI)在酸性条件下(pH 4)乳化性能的效果,本文以大豆分离蛋白为原料,以乳化性能和乳状液粒径为衡量指标,确定超声波联合植酸酶-酸性蛋白酶(Ultrasound combined with phytase-acidic protease,Uphy-aci)改性方法的最适宜条件。研究发现,当SPI浓度6%,植酸酶添加量4 U/g,酸性蛋白酶添加量1500U/g,植酸酶与酸性蛋白酶的酶解时间分别为50 min和30 min时,改性后的SPI(pH 4)乳化性能明显增加,乳状液粒度减小;通过表面疏水性(H0)和扫描电镜(SEM)分析了超声波-酶复合改性处理的SPI,发现在酸性条件下,SPI表面疏水性含量为487.78,比未改性提高了71.2%,并呈现破碎均一、多孔的微观结构。因此,超声波与植酸酶-酸性蛋白酶联合改性提高酸性条件下SPI的乳化特性等功能性质,并且拓宽了大豆分离蛋白的应用领域。     

碱性蛋白酶控制酶解诱导大豆分离蛋白纳米颗粒的形成机制

以大豆分离蛋白（soy protein isolate,SPI）为原料,利用碱性蛋白酶对其进行酶解处理（0～24 h）,探究SPI的结构变化规律,发现碱性蛋白酶控制酶解可诱导SPI自组装形成系列分布均匀（多相分散系数＜0.3）、粒径可控（90～200 nm）且具有不同表面特性的大豆蛋白纳米颗粒（soy protein nanoparticles,SPNs）,其中水解度（degree of hydrolysis,DH）及亚基解离/降解是影响SPNs形成的关键性因素。酶解初期（10～30 min,DH约3%）,SPI中β-伴大豆球蛋白（7S）组分α与α’亚基的部分降解有利于两亲性结构的释放,提高蛋白表面疏水性,降低临界聚集浓度,形成包含相对完整的7S及大豆球蛋白（11S）亚基的I类纳米颗粒（SPNs-DH 3%）。随着酶解时间的延长（1～2 h）,α与α’亚基的进一步降解促进了疏水性β亚基与B亚基的暴露,增强的疏水相互作用导致体系浊度增加,其中可溶性聚集体向不溶性疏水聚集的转化使得蛋白表面疏水性急剧下降,形成以A亚基及部分β亚基为主导的II类亲水型纳米颗粒（SPNs-DH 5%）。酶解后期（4～24 h）,A亚基的进一步降解则产生更多亲水性多肽,不利于纳米颗粒的形成。进而探究SPNs的形成机制,圆二色光谱结构表明,SPNs的形成与蛋白α-螺旋和无规卷曲结构向β-折叠转化有关。两类SPNs的整体结构均由疏水相互作用维持,而氢键和二硫键分别参与颗粒表面与内部结构的形成。与SPNs-DH 3%相比,SPNs-DH 5%中形成了更多由二硫键与氢键稳定的折叠结构。此外,由于酶解过程中不断释放抗氧化肽段,其所形成SPNs的抗氧化性较原始SPI均有所提升。     

Expression of proteases by Rhizopus species during Tempeh fermentation of soybeans

Expression of proteolytic activities by nine Rhizopus strains during soybean fermentation to produce Tempeh has been determined. All strains showed activity at acidic, neutral, and alkaline pH values. In protein solubilizates prepared from Tempeh pronounced differences in the time course and intensity of maximum protease activities were observed between the isolates when measured at pH 7, the approximate pH of Tempeh during ripening. Proteases expressed by fungi during growth on Tempeh were solubilized and the enzymes were enriched by acetone precipitation and chromatographies with Phenylsuperose, Mono S, and Mono P, respectively. They were identified as one aspartic- (∼35 kD) and one serine (∼33 kD) protease, each existing in different isoforms. Proteases isolated from Tempeh were identical to those expressed during fungal growth in a soyprotein-raffinosephytate liquid medium. The temperature stability of the Tempeh- and the cell wall-isolated proteases is very low in contrast to the proteases secreted into the medium. Proteases isolated from Tempeh, cell walls and liquid media exhibit differences in the number of alkaline isoforms.     

毛霉AS3.2778脯氨酸氨肽酶的部分纯化及性质研究

毛霉蛋白酶对大豆蛋白有较高的水解效率并对蛋白水解物有良好的脱苦效果,因此在大豆多肽的制备方面显示出很好的应用前景。为了开发这一蛋白酶系,实验中P采用硫酸铵盐析、离子交换层析、疏水层析及凝胶层析等方法对其进行了分离纯化,从雅致放射毛霉AS3.2778的发酵麸曲中部分纯化得到一氨肽酶组分,并对其性质进行了探讨。纯化的毛霉氨肽酶是一典型的脯氨酸氨肽酶,它对小肽N端的脯氨酸有非常强的水解能力;该氨肽酶在40～45℃、pH6.5有最大催化活性,在30℃以内,pH5.0～8.0有很好的稳定性;在所试验的几种蛋白酶抑制剂中,仅1 mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)对毛霉氨肽酶有抑制作用,由此说明纯化的毛霉氨肽酶可能是一种丝氨酸蛋白酶;常见金属离子对该氨肽酶活性的影响不明显;脱苦实验结果表明,纯化的毛霉氨肽酶对于大豆蛋白水解物的苦味有明显的去除效果。     

纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶及其代谢特性分析

对纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）液态发酵荞麦产纳豆激酶揺瓶、2.5 L发酵罐条件进行优化。对比自制大豆分离蛋白酶解物与商业大豆蛋白胨作为补充氮源时菌体生长规律以及代谢物质（酶、可溶性蛋白、还原糖、多酚及抗氧化物质）变化规律。纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶2.5?L发酵罐最优条件为荞麦浸泡6?h后,按料液比1∶10（g/mL）加水打浆,加入0.4%?α-淀粉酶,90?℃加热40?min,补充NS37071酶解12?h时所得酶解物,调节发酵培养基pH?7.0,接种量3%,通气量3.5?L/min,转速300?r/min,装液量1.2?L,发酵36?h。与商业大豆蛋白胨相比,补充大豆分离蛋白酶解物时,纳豆菌生长对数期较长,可溶性蛋白与还原糖的消耗量较大,在36?h趋于平稳,纳豆激酶活力持续上升至36?h达到最大值,酚类物质比溶出速率在12?h达到最大值,抗氧化物质比生成速率在6?h达到最大值。以荞麦为原料,补充自制大豆分离蛋白酶解物,通过优化纳豆菌液态发酵条件,可制备具有高纳豆激酶活力（152.5?FU/mL）、富含谷物多酚（0.109?mg/mL）且具有强抗氧化活性（27.43?μmol/mL）的发酵产物。