牛αsl乳酪蛋白基因上游调控序列的克隆及序列分析

应用ＰＣＲ技术从国内小牛胸腺基因组ＤＮＡ中克隆了１．０ｋｂ牛αｓｌ酪蛋白基因的上游调控序列，并进行了序列分析，发现有少量的缺失或突变，其ＴＡＴＡ框和ＣＡＡＴ框均未发生变异，表明已成功克隆了其启动子序列，这为乳腺定位表达的研究奠定了基础。     

慢生型大豆根瘤菌nfeC基因的克隆及序列分析

通过亚克隆,将重组质粒pGXN201中与nfeC基因同源的片段定位在4kbClaI XbaI片段上,序列分析表明该片段全长4038个碱基,该片段上含有一个完整的阅读框架,该阅读框架编码一个含275个氨基酸的多肽,与已报道的nfeC基因编码的蛋白质具有93%的同源性。     

斑马鱼ILF2基因的电子克隆分析

利用电子克隆方法,成功获得了ILF2基因在斑马鱼中的同源基因,为进一步研究斑马鱼ILF2基因功能奠定了基础.斑马鱼ILF2基因cDNA全长为1560bp,含有一个编码387个氨基酸的完整开放阅读框架.比较斑马鱼ILF2基因和人ILF2基因,显示两者编码氨基酸序列相似性为87%,核苷酸序列有72%相同.     

快生型大豆根瘤菌3.7Kb增效片段的亚克隆与序列分析

利用柯氏质粒ｐＬＡＦＲ１为载体构建了快生型大豆根瘤菌Ｂ５２菌株的基因文库，并通过植物结瘤试验筛选到一个３．７Ｋｂ增效片段，将其导入慢性型大豆根瘤菌２２１０，能提高其共后固氮效率。     

中国庚型肝炎病毒NS3区部分基因的克隆与基因特点的分析

利用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从我国一输血后丙型肝炎病人血清中克隆到了庚型肝炎病毒ＮＳ３区的部分基因。经序列分析表明：我国庚型肝炎病毒ＮＳ３区与已知的ＧＢＶ－Ｃ及ＨＧＶ的核苷酸同源性在８１．７—８８．０％之间，而氨基酸同源性均大于９６％，氨基酸序列与ＨＣＶ、ＧＢＶ－Ａ、ＢＧＶ－Ｂ具有一定的结构相似性及数个共有的保守位点。     

大豆NBS类抗病相关基因的克隆与序列分析

根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR方法从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA中扩增获得两个通读的大豆NBS类抗病基因同源片段RNEAU-1和RNEAU-2,长度均为513bp,编码171个氨基酸。以RNEAU-1为靶序列,采用RACE方法获得了全长3574bp的大豆抗病相关基因SR1,该基因包括3411bp的开放读码框,72bp的5′非翻译区(non-translated region,NTR),68bp的3′非翻译区和20bp的多聚腺苷酸尾。编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列,基因编码产物具有TIR、NBS、LRR、HD(conserved domain 1)和conserved domain 2等一系列抗病基因的保守结构域。同源性比较和序列分析显示,该基因为大豆中TIR-NBS-LRR类抗病相关基因。Southern杂交结果表明,SR1基因(或其同源基因)在大豆中具有2～4个拷贝。RT-PCR检测表明,SR1基因在大豆中为低丰度组成型表达,其表达不受病原菌接种和水杨酸的诱导,亦无组织特异性。以绥农10号基因组DNA为模板扩增得到长度为3972bp的SR1基因转录区核苷酸序列,其结构包含5个外显子和4个内含子。SR1基因在GenBank上的登录号为AY193892。     

人血小板生成素（hTPO）的cDNA克隆与序列测定

由于人血小板生成素ｃＤＮＡ的阅读框架较长而且序列中无合适的酶切位点，因此，我们利用一个同义突变创造的ＫｐｎＩ酶切位点人为将ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ分成Ｎ－端和Ｃ－端两个片段。首先利用反转录聚合酶链式反应从人胎肝ｍＲＮＡ中分别扩增出两个ｃＤＮＡ片段，于ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ位点分别克隆入测序载体ｐＵＣ１９中。     

Bak基因的克隆,测序及表达

Ｂｃｌ－２蛋白家族在细胞编程死亡的调控中起重要的作用。本文报导了Ｂｃｌ－２家族新成员Ｂａｋ的克隆、测序及其在大肠杆菌中的表达过程，为研究细胞编程死亡以及Ｂａｋ在其中的作用机制提供了重要的依据。     

茶尺蠖普通气味结合蛋白基因片段cDNA的克隆与序列分析

根据同源性设计简并性引物,采用RT-PCR方法扩增出了茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBP1和GOBP2的基因cDNA片段,大小分别为415 bp和352 bp.测序结果在NCBI中经BLAST搜索,结果表明,两者与已报道的鳞翅目昆虫的气味结合蛋白基因片段或全长的同源性分别为79%~83%和78%~90%.根据两个核苷酸片段推导出的氨基酸残基数分别为138个和117个,均具有6个保守的半胱氨酸位点,符合典型的气味结合蛋白的特点.经BLAST搜索,与其他鳞翅目昆虫GOBP1和GOBP2氨基酸序列的同源性分别为62%~82%和76%~88%.     

水稻小GTP蛋白基因Osrab5B基因的克隆和鉴定

用已知遗传图位的BAC克隆片段,对水稻（Oryza sativa)小穗cDNA文库进行筛选,获得一个水稻小GTP结合蛋白（small GTP-binding protein,SGP)的相关序列,序列测定后以该cDNA序列为基础将４个表达序列标记（EST）进行了电子克隆（electronic cloning),根据电子克隆结果设计引物,利用RT－PCR方法获得了一个水稻（Oryza stiva)中尚未鉴定的cDNA克隆Osrab5B,长1016bp。它与龙船海棠属（Mesembryanthemum crystallinum)和百脉根属（Lotus japonicus)命名为rab5B基因（序列登录号分别是AJ006225和Z73939）有着高度同源性（cDNA核苷酸序列ID值分别大于74％和76％）,同属rab家族的一个新的亚族。进而根据Osrab5B的cDNA序列设计引物,扩增得到Osrab5B的基因组克隆,序列分析表明它至少有7个内含子和8个外显子。     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离,并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果,且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定,以及对该序列的同源性分析后,设计出相应引物,用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明,该克隆基因全长1588bp,有一个全长1149bp的编码区序列,推测蛋白质序列长383个氨基酸残基,成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列,说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明,该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。     

节旋藻硝酸盐转运蛋白基因Amnrt P序列分析

应用生物信息学软件对获得的节旋藻硝酸盐转运蛋白基因(Amnrt P)全长序列进行了结构特征、同源性比较、多序列比对、系统发育学分析等.结果表明:该基因全长为1515 个核苷酸,编码 504 个氨基酸,平均 GC 含量为43.8%,疏水氨基酸的比例为47.6%.该硝酸盐转运蛋白含有 12 个跨膜结构域(Transmembrane domains,Tm),膜拓扑结构与 NRT2 家族的类似,并发现了多个 NRT2 家族的保守序列.同源性搜索显示与属于 NRT2 基因家族的海洋蓝藻的氨基酸序列相似性为75%～89%.采用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建了分子系统树,结果表明 3 种树的拓扑结构基本相似,并且在蓝藻中基于硝酸盐转运蛋白基因的系统发育关系与形态学分类结果相一致.所获 Amnrt P 基因属于 NRT2 基因家族,可成为蓝藻系统进化研究的分子标记,并为了解节旋藻中硝酸盐吸收与转运的基因结构和分子机制奠定了一定的基础.     

节旋藻FACHB341 Rubisco基因部分序列的克隆和分析

以节旋藻FACHB34l为材料，对所克隆Rubisco基因进行了核苷酸序列测定和分析，由此推导出相应的氨基酸序列，并与部分其他蓝藻的同源基因进行了同源性分析。结果表明：所克隆DNA片段包含Rubisco大小亚基基因部分序列及rbcX基因序列，长度为2073bp，其中rbcL和rbcX基因之间存在两个转录茎环结构；大小亚基酸性氨基酸和碱性氨基酸的比例分别为13．14％和14．51％，疏水氨基酸的比例为42．16％；rbcL核苷酸序列与集胞藻PCC6803、Prochlorothrix hallandica、聚球藻PCC630l、Agmenellum quadruplicatum和鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性分别为91．7％、79．9％、74．8％、77．2％和76．1％；rbcS核苷酸序列与鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性为67．6％，而与PCC630l和集胞藻PCC7002同源序列的相似性分别为30．1％和63．8％。     

牛α(1,3)-半乳糖转移酶基因片段的克隆及一种全新的无启动子打靶载体的构建

利用La—PCR的方法，从牛的基因组中成功地获得分别约为2．4kb、15．0kb的两段扩增产物。两个片段分别克隆于pCR—XL—TOPO载体。测序结果表明所克隆的两片段均为牛α(1，3)GT基因的基因组序列。其中2．4kb片段位于5～7外显子之间，包括了完整的第五及第六内含子；15．0kb片段位于3～4外显子，包括了完整的第三内含子。15．0kb、2．4kb片段分别作为打靶载体的5’、3’同源臂，使用融合基因策略构建了一种全新的无启动子打靶载体7zf-neo17．4。电击转染牛胎儿成纤维细胞以期敲除牛的α(1，3)-GT基因。     

长爪沙鼠Tim-1基因部分序列克隆及表达分析

根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)中基因库(GenBank)里查询到已登录的小鼠、大鼠的Tim-1mRNA序列,通过同源比较,设计引物,首次对长爪沙鼠Tim-1基因部分编码序列进行分子克隆.经过PCR扩增,获得长爪沙鼠Tim-1基因243bp部分编码序列,经测序后登录GenBank(JN628997),发现该序列与小鼠、大鼠Tim-1相应部分有80%以上的相似性.利用所克隆的序列设计引物,建立荧光定量PCR方法检测长爪沙鼠Tim-1基因在不同组织中表达情况.结果显示,长爪沙鼠Tim-1基因在不同组织中表达差异性较大,其中在肾脏组织中表达水平高于其他组织,在肌肉、心脏、小肠、脾脏、肝脏、肺组织中表达均较低.     

柱花草核rDNA的ITS1序列分析

首次对42个柱花草种质的ITS1序列进行了比较分析.结果表明:42个炭疽病敏感与抗病柱花草种质的ITS1序列长度变化范围为302～314 bp,G C含量的变化范围为44%～45%;在它们的 ITS1序列中,有8个插入位点,13个缺失位点,68个变异位点;并在15个限制性酶切位点上也存在差异;种质间的遗传分化距离变异范围为0.006～0.053,平均值为0.021.采用非加权成对平均数法(UPGMA)构建了聚类树系图,42个柱花草种质可分为两大类、15个小类.该结果较好地反映了这些种质的差异.     

哈茨木霉菌Tri101基因的克隆与序列分析

根据拟枝孢镰刀菌等真菌中Tri101的保守序列设计简并引物,利用简并PCR和基因组步行法克隆了哈茨木霉菌Tri101基因.结果表明:Tri101基因的开放阅读框为1 314 bp,无内含子存在,与预计的Tri101序列特征一致.该基因编码蛋白质由437个氨基酸组成,预测相对分子质量约为4.75 kD,系统进化树显示其与棒曲霉(Aspergillus clavatus)NRRL 1亲缘关系最近,与NRRL 1中3-O-乙酰转移酶的的蛋白质同源性达到55%.Blast数据库分析表明其属于转移酶总科,单端孢酶烯乙酰转移化酶.以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)TRI101蛋白(Parent PDB:3b2s Chain:A)的晶体为模板进行了同源建模,为进一步研究该基因的功能奠定基础.     

外来入侵生物福寿螺β-actin基因片段的克隆及表达分析

采用RT-PCR的方法首次对入侵我国福寿螺的β-actin基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并通过氨基酸序列分析推导与其他相关物种的亲缘关系.结果表明,获得的福寿螺β-actin基因cDNA片段大小为840bp,核酸编码有280个氨基酸序列,与其他物种具有高度的同源性.通过邻接法(NJ)构建的系统发育树显示,福寿螺首先与软体动物聚为一簇,然后与节肢动物聚为一簇,再与脊椎动物聚为一簇.此外,RT-PCR结果显示,β-actin基因在福寿螺的鳃、消化腺、肾和足部肌肉等4个组织内的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

雌核发育银鲫四种孵化酶基因全长cDNA的克隆及其特征分析

用抑制性差减杂交结合SMART cDNA合成和RACE-PCR技术，克隆得到雌核发育银鲫(Carassius auratus gibelio)4种孵化酶基因的全长eDNA。4种孵化酶基因分别被命名为GHEl、GHE2、GHE3、GHE4。序列分析表明，4种孵化酶基因cDNA的开放阅读框均为795bp，都编码265个氨基酸。它们推断的编码氨基酸序列同源性在79．6～95．1％之间。种系分析表明，GHEl、GHE2、GHE3、GHE4的进化地位位于日本鳗鲡(Anguilla japonica)孵化酶和青鳉(Oryzias latipes)孵化酶之间。不同发育时期胚胎的RT-PCR分析表明，银鲫GHEl、GHE2、GHE3、GHE4 4种孵化酶基因从尾芽期到幼苗期都检测到表达，且GHE3和GHE4在神经胚期也检测到表达。各种组织的RT-PCR表明，它们在成鱼组织中不表达。