甘蓝型油菜BnERF50的超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

从接种核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）后的甘蓝型油菜品种中双9号cDNA芯片中筛选出一个新的抗性相关基因BnERF50。序列分析表明该基因产物BnERF50蛋白含有一个典型的ERF（乙烯相应转录因子）保守结构域,属于ERF家族成员。接种核盘菌24h后,该基因的表达量被诱导显著上调。在它的超表达转基因拟南芥中,病原相关蛋白（PR）防御素基因PDF1.2和几丁质酶基因ChiB的表达量升高,对腐生营养型真菌核盘菌的抗性显著增强。     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁RS-1的SSH文库构建

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）对幼苗进行接种,提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减（SSH）cDNA文库。正向消减文库是以诱导后的宁RS-1 cDNA为tester,以正常的宁RS-1 cD-NA为driver。所构建的正向文库重组率达到96.2%,反向文库重组率达到94.5%,文库容量均达到了2 190和2 780,表明所构建的文库质量良好。对从文库中随机挑取的克隆进行测序分析,获得了与抗病和代谢有关的基因,如γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因、抗真菌蛋白基因、铁蛋白基因、ACC氧化酶基因等,为开展油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。     

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA（amiRNA）干扰载体（该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因）转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强（P〈0.05）。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。     

与甘蓝型油菜隐性核不育rf基因连锁标记的开发

甘蓝型油菜不育系20118A为三隐性上位互作遗传模式,其不育性受两对重叠隐性不育基因（a和6）与一对隐性上位抑制基因（仍互作控制。矿基因纯合时对a和b基因起抑制作用,使油菜育性恢复,可用于核不育三系法育种。为缩短临保系的育种周期,本文利用一个20118A与其I临保系M-6029的BC1分离群体获得了7个与矿连锁的AFLP（扩增片段长度多态性）标记,构建了局部连锁图,图距在3cM-17cM。其中距矿最近（3cM）的标记为EAIOMC03。用引物对乃和R3成功地将EAl0MC03转化成SCAR（序列特异性扩增区）标记,能区分杂合型Rfrf单株和纯合型RfI讧单株,为分子标记辅助选择隐性核不育临保系奠定了基础。     

共表达HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡萄糖氧化酶的影响

通过增强不可折叠蛋白质响应(UPR)信号途径以及研究不同培养温度下的影响,来提高重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。影响毕赤酵母外源蛋白表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力。通过共表达HAC1基因对不可折叠蛋白信号通路进行调控,摇瓶中改造菌株PP-G-HAC1胞外酶活达到161 U/m L,相比于原始重组葡萄糖氧化酶菌株提高了34%。进一步研究不同温度下过量表达HAC1基因对菌株的生长和分泌外源蛋白的影响,菌株PP-G-HAC1在3 L发酵罐中28℃培养,酶活达到1 008 U/m L,胞外重组蛋白质达到14.43 g/L,相比原始菌株在相同条件下提高了3.12倍。     

白芥和甘蓝型油菜属间杂种后代菌核病抗性鉴定

通过对24个白芥和甘蓝型油菜属间杂种回交后代株系叶片菌核病菌丝接种鉴定,发现有11个株系与抗病品种中双9号抗性差异不显著,有4个株系抗性极显著强于中双9号。茎秆接种也验证了这个结果。结果表明,白芥和甘蓝型油菜属间杂种后代部分株系抗菌核病能力得到明显提高,对创造抗菌核病油菜新种质具有重要意义。     

油菜菌核病菌对嘧菌环胺和不同杀菌剂敏感性的相关分析

为了明确油菜菌核病菌对新型杀菌剂嘧菌环胺的敏感性和该药剂与其它杀菌剂的交互抗性,采用菌丝生长速率法测定江苏省不同地区的53个油菜菌核病菌菌株对嘧菌环胺的敏感性,并测定对嘧菌环胺不同敏感性的10个菌株对菌核净、异菌脲、腐霉利、多菌灵、咪鲜胺和戊唑醇等杀菌剂的敏感性。结果表明,菌株间对嘧菌环胺的敏感性差异显著,EC50（抑制中浓度）值在0.0342～1.087 6μg/mL之间;通过EC50值相关性分析,油菜菌核病菌对嘧菌环胺与上述杀菌剂之间不存在交互抗性。     

向日葵品种资源对菌核病抗性室内鉴定

利用两种不同的培养基培养核盘菌,用离体叶片接种方法对40个不同向日葵品种进行室内抗性鉴定,结果表明：在Minimal medium培养基上生长的核盘菌和PDA培养基相比,菌丝的生长速度大大降低。菌株经PDA培养基培养接种向日葵叶片后,不同向日葵品种之间抗性水平没有显著差异;而用Minimal medium培养基培养的菌株接种供试的向日葵不同品种叶片后,品种间表现出一定的抗性水平差异。依据接种后不同品种抗性水平的差异将供试向日葵品种划分为三组,即：抗病品种如食葵765、油葵KS7等,共3份;耐病品种如3146、新葵杂5号等,共9份;感病品种如LD1093、新葵杂6号等,共28份。     

戊唑醇对油菜菌核病菌作用机制的探讨

为探明戊唑醇对油菜菌核病的防治效果及作用机制,采用生物测定方法,研究戊唑醇的室内毒力、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）的菌丝干重、菌丝蛋白质含量、菌核萌发、菌核致病力和菌丝体细胞膜电导率。结果表明：戊唑醇对油菜菌核病菌具有极强的抑菌作用,EC50和EC90值分别为1.3μg/mL和11.2μg/mL;用戊唑醇处理后,菌丝体干重差异显著,蛋白质含量、菌核萌发率和致病力均随处理浓度的提高而降低;戊唑醇对菌丝体电导率无影响,但对菌丝体的生长有抑制作用。表明戊唑醇通过抑制菌丝干重、菌核萌发率、蛋白质含量和致病力而控制病害发生。     

油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的生理生化特性及抗药机制初步分析

通过室内紫外线和药剂诱导,获得多株高抗腐霉利油菜菌核病菌（Sclerotiniasclerotiorum）突变体。与野生亲本菌株相比,抗性突变株（EC50〉800μg/mL）在高糖（〉40g/L蔗糖）和高盐（〉5g/LNaCl）培养基上生长缓慢,表明对高渗透压比较敏感;菌丝相对电导率较高,显示细胞膜透性增大,胞内电解质渗出较多。试验还发现,在含药培养液中,亲本菌株菌丝内甘油大量合成和积累,增加462.45%,而抗药突变株甘油含量仅稍有增加或有所下降,说明抗腐霉利突变株对外界渗透压的调节能力较低。根据已报道组氨酸激酶（HK）基因序列设计特异引物,经PCR扩增和测序,获得油菜菌核病菌HK基因保守区域序列1605bp。抗、感腐霉利菌株HK基因保守区域在第45位、第81位和第625位碱基不同,但编码的氨基酸一致。因此,油菜菌核病菌对腐霉利的抗性及抗药菌株的高渗敏感性与HK基因保守区域碱基突变无关。     

不同地域和寄主来源的核盘菌遗传多样性分析

为了解核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]遗传多样性和进化关系,利用SSR分子标记对采自不同地区和寄主来源的32个核盘菌分离物进行分析,17对SSR引物共检测到69个多态性位点,平均每对引物检测到4.06个位点。其中,引物AF377908-1/AF377908-2和AF377922-1/AF377922-2的等位变异数目最多,高达8个,而引物AF377903-1/AF377903-2和AF377925-1/AF377925-2的等位变异数目最少,为2个。17个SSR引物的多态性信息量（PIC）的平均值为0.56,引物AF377922-1/AF377922-2的PIC最高,为0.78。聚类分析显示,32个核盘菌分离物可划分为5个组群,来自同一地区的大部分核盘菌分离物聚在相同或相近的组内,表明核盘菌群体内的SSR遗传背景基本一致,而群体间的遗传变异较大。     

利用微卫星标记分析核盘菌遗传多样性

利用微卫星（SSR）标记,分析来自欧洲和中国的30个核盘菌菌株的遗传多样性和群体结构。结果表明,3对微卫星引物共扩增出21条清晰的谱带,平均每对引物扩增7条谱带,片段长度为158bp～358bp。根据SSR分析结果,30个核盘菌分离物具有较高的遗传相似性。物种水平的Nei遗传多样性指数为0.139 3,Shannon多样性指数为0.248 8。不同菌株群体的Nei遗传距离都较小,为0.009 6～0.049 6。其中俄罗斯群体和奥地利及英国群体之间的遗传距离最大。从30个菌株的UPGMA聚类分析结果看,核盘菌群体结构与地理来源没有明显的直接关系。许多地理来源相同的菌株分散在不同的组里。仅第三组组内的菌株地理来源一致,均来自于中国,且遗传距离比其他菌株的远。群体遗传分析显示,总群体的基因流比较高（2.111 6）,基因分化系数比较低（0.191 5）。