甘蓝型油菜BnKNAT2基因克隆和功能分析

为分析甘蓝型油菜中调控分生组织细胞特异分化的KNOX基因家族成员KNAT2,从品种中双11号中分离克隆了BnKNAT2基因,ORF长984bp,由5个外显子组成,该基因编码327个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质包含有KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox KN结构域,属I类KNOX蛋白。甘蓝型油菜中BnKNAT2存在4个拷贝,在主花序（原基）、授粉后7d的角果和茎中活跃表达。利用35S启动子构建了BnKNAT2的超表达载体（pD1301SBnKNAT2）转化拟南芥野生型Col-0。21个转基因株系（T2）的叶片呈现不同程度卷曲、蜷缩以及波纹状叶缘。另外,BnKNAT2转基因株系开花期相比野生型明显推迟。     

甘蓝型油菜表皮特异硫蛋白(ESP)的序列分析及其诱导表达

为了揭示植物激素及环境胁迫对甘蓝型油菜(Brassica napus)表皮特异硫蛋白(ESP)表达的影响,以中双9号品种为材料,采用同源克隆法获得一编码甘蓝型油菜表皮特异硫蛋白(BnESP)的cDNA,序列分析表明其编码蛋白BnESP含有343个氨基酸,与青花菜(Brassica napus)ESP有99%的相似性,与拟南芥腈特异性蛋白、类黑芥子酶结合蛋白、茉莉酸诱导蛋白有较高的同源性。荧光定量RT-PCR分析显示,甲基茉莉酸和机械伤害快速激活BnESP的表达,苯丙噻重氮和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)抑制其表达。研究证明BnESP是茉莉酸诱导蛋白,可能在水杨酸和茉莉酸信号的互作及油菜对S. sclerotiorum的反应网络中起作用。     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、向日葵等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1∶1、BnSAD2∶1、BnSAD2∶2和BnSAD2∶3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP（C18∶0-ACP）脱氢生成油酰基ACP（Δ9C18∶1-ACP）的过程,尤其是BnSAD2∶3可能为种子特异表达基因。     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶（Arginine decarboxylase,ADC）基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5＇非翻译区（5＇Untranslated region,5＇-UTR）、226bp的3＇非翻译区（3＇Untranslated region,3＇-UTR）和2 079bp的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75.1kD的蛋白质。5＇-UTR中含有12bp的uORF（Upstream open readingframe）,编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a（＋）-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21（DE3）,SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E.coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

甘蓝型油菜BnPexl6p基因cDNA的克隆与表达

利用模式植物拟南芥AtPexl6p／SSEl基因序列与油菜数据库BBSRCBrassicaDB比对,得到甘蓝型油菜（Brassica napus）同源EST序列,拼接出油菜Pexl6p基因全长eDNA电子克隆,然后设计全长引物,以甘蓝型油菜种子eDNA为模板,克隆Rexl6p基因,得到全长为1101bp的eDNA,编码366个氨基酸的蛋白,命名为BnPexl6p。Bn-Pexl6p基因序列与拟南芥AtPexl6p／SSE1同源,其蛋白与拟南芥同源蛋白具有完全相同的vrs2型过氧化物酶体定位肽,进化关系相近。半定量PCR（RT—PCR）发现BnPexl印基因在油菜幼嫩的根、茎、叶和种子中均有高丰度表达,在种子发育过程的中期和后期表达水平增加,暗示该基因在油脂的积累中有重要作用。     

普通烟草KCS基因家族的鉴定及非生物胁迫表达模式分析

【目的】为探究烟草KCS基因在非生物胁迫下所起的作用。【方法】采用生物信息学方法对烟草KCS基因进行系统进化、共线性和表达模式等分析。【结果】从普通烟草中鉴定出41个KCS基因;拟南芥和新鉴定的烟草KCS基因可划分为8个亚组,大部分亚组均含拟南芥和烟草成员;10个NtKCS成员源自全基因组复制事件,NtKCS10和NtKCS11是AtKCS02的同源基因,可能具有相似的生物学功能;普通烟草KCS基因启动子含多个与胁迫相关的顺式作用元件,其成员的表达具有一定的组织特异性;在盐和干旱胁迫下,NtKCS09、NtKCS11和NtKCS16表达量均有提高,可能参与烟草胁迫响应等信号传导过程。【结论】本研究对普通烟草KCS家族成员进行了系统的鉴定与分析,为深入研究烟草KCS家族基因的生物学功能奠定理论基础。     

红曲菌Mn-SOD基因克隆、表达及序列分析

为得到产Mn-SOD工程菌及表达产物,通过设计出红曲菌H4000 Mn-SOD简并引物得到目的基因片段,再设计全长引物利用PCR技术扩增红曲霉Mn-SOD基因的全长序列。经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后连接至相同酶切的表达载体pET28a,并转化至E.coli BL21进行诱导表达。克隆得到的基因预测编码152个氨基酸,预测相对分子量为17 kDa。同时,将克隆得到的Mn-SOD基因与NCBI数据库进行比对,发现该序列与橙色红曲霉超氧化物歧化酶(SOD)基因相似度达到99%,与炭疽菌、米曲霉、黄曲霉的Mn-SOD基因也有较高的相似度。通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况,目标蛋白相对分子质量约为19 kDa,与预测分子量基本相符。该表达蛋白在pH2.0保温处理1 h,仍具有较高的Mn-SOD酶活。     

大豆rbcL基因克隆、序列分析及原核表达

利用叶绿体基因组保守性的特征,根据菜豆、豌豆、烟草的rbcL基因序列设计引物,从大豆叶绿体DNA中克隆rbcL基因,全长序列为1488bp,包括1449bp的开放阅读框,编码482个氨基酸。相似性比较显示,此序列与其它10个物种rbcL基因核苷酸的同源性为85．37％～95．31％,氨基酸的同源性为90．87％-96．47％。将该基因与表达载体pET-30a（＋）连接,转化大肠杆菌Rosseta感受态细胞,PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,阳性菌液IPTG诱导后经10％SDS—PAGE分析,结果显示,诱导表达出分子量约为60kD的特异融合蛋白。     

脂肪酶的基因克隆、序列分析、高效表达及其催化特性

分别以R. miehei 3.4960基因组和总RNA为模板,通过PCR和RT-PCR扩增得到脂肪酶全长基因和脂肪酶cDNA碱基序列,两碱基序列测序结果比对表明：脂肪酶DNA碱基序列由5个内含子和6个外显子组成,5个内含子大小分别为75、58、64、73、59bp,位于DNA序列(以起始密码子ATG的碱基A为1)的600～674位、929～986位、1076～1139位、1227～1299位、1382～1440位碱基处。脂肪酶RML mRNA碱基序列与已公布的R. miehei脂肪酶基因mRNA(EMBL Nucleotide Sequence Database Accession No. A02536)碱基序列有5个碱基的差异,其编码的氨基酸序列有1个发生了改变。利用酿酒酵母表达质粒pICAS1,实现了脂肪酶RML基因在酿酒酵母中的高效分泌表达,并对重组脂肪酶RML进行了相关酶学性质分析。酶学性质研究表明：重组酶的最适反应温度为45℃,最适pH值为8.6;该酶偏爱中链长的酯(C8～C12),对12个碳的酯具有最佳活性,对C16长链酯也有较高的活性,对短链酯的活性较弱;金属离子Cu2+、Fe2+对酶活性有显著抑制作用,Ca2+和Mg2+对酶活有部激活作用。     

枯草芽孢杆菌QM11漆酶基因克隆表达及序列分析

为获得高效表达的产漆酶工程菌,将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的漆酶（cotA）基因在大肠杆菌中表达。用PCR的方法从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）QM11基因组中扩增cotA基因,连接载体pET22b构建成表达载体pET22b-cotA,转化至E.coli BL21（DE3）进行诱导表达,最终通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况。克隆得到的cotA基因含有1542个核苷酸,由513个氨基酸组成,预测相对分子量为58 ku,理论等电点为5.91,无信号肽,二级结构以β-折叠和无规卷曲为主,其中β-折叠占26.71%,无规卷曲占52.05%,与NCBI已公布的Bacillus subtilis漆酶cotA基因（Gen Bank:GQ184294.1）碱基序列有12个碱基的差异,其编码的氨基酸序列有4个发生了改变。通过SDS-PAGE检测,目标蛋白相对分子质量约为54 ku,与预测相对分子量基本相符。      

甘蓝型油菜AnnBn1基因的克隆和表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术从甘蓝型油菜抗旱品系Q2中克隆了膜联蛋白（annexin）基因,命名为AnnBn1（GenBank登录号HM244482）,并对其进行了表达分析。AnnBn1的开放阅读框长度为954bp,编码317个氨基酸。序列分析推测AnnBn1基因编码的氨基酸序列含有4个重复的结构域及钙离子结合位点,与拟南芥、番茄、棉花和玉米等物种的膜联蛋白具有较高的同源性。荧光定量PCR结果发现AnnBn1基因在Q2的根、茎、叶、芽等组织中均有表达,而且表达量基本相同。对3叶期幼苗进行10%PEG（聚乙二醇）溶液模拟干旱时发现,干旱胁迫后30h内,AnnBn1基因在茎、芽中的表达量升高了2～4倍,而在叶、根中显著升高了10倍以上。AnnBn1基因表达峰值也具有时空特点,干旱胁迫后20h茎和芽中表达量高,而在30h之后叶和根中表达量高。     

DCE-01菌株果胶酯酶基因克隆与表达

从麻类脱胶高效菌株DCE-01中克隆果胶酯酶基因并进行原核表达。根据全基因组测序注释结果设计引物,PCR扩增果胶酯酶基因连接到pEASY-E1载体上,导入大肠杆菌进行诱导表达,采用水解圈法进行选择和定量分析。结果表明:克隆出全长1107bp的果胶酯酶基因（GenBank登录号:KC422449）,编码368个氨基酸;该基因表达蛋白质序列的前26个氨基酸为信号肽,前导蛋白的分子量约为39.6ku,成熟蛋白为36.9ku,pI为9.1;基因工程菌株以高度酯化橘子果胶为底物的发酵液粗酶活为1.5IU/mL,是原始菌株DCE-01的22.4倍。本研究成功发掘出果胶酯酶基因,其表达产物果胶酯酶能降解高甲氧基果胶,在低甲氧基果胶制备方面具有重要应用前景。      

利用青海大黄油菜和芥蓝合成大粒甘蓝型油菜

利用青海大黄油菜（QD,2n=20,AA）与几种不同的甘蓝（CC,2n=18）正反杂交,辅以幼胚抢救、子房培养和染色体加倍技术人工合成甘蓝型油菜。结果表明：以QD为母本的多个杂交组合获得69株杂种苗,反交组合均未得到正常发育的胚。与中迟芥蓝杂交后的QD子房在MS、1/2MS、MS＋0.2mg/L 6-BA三种培养基中得胚率依次为15.5%、8.9%和4.4%,共获得24个杂种胚,而在MS＋1.5mg/L 6-BA＋0.25mg/L NAA分化培养基上角果内未发现成熟胚。染色体加倍处理结果表明,在培养基中添加秋水仙素后加倍率最高（59.4%～86.4%）。SSR分子标记结果显示：受试材料全部为真杂种,并且没有出现新增带和缺失带。人工甘蓝型油菜在形态上介于双亲之间,千粒重较高,达到5.48g～7.45g,显著高于甘蓝型油菜品种青油14号和中双4号。     

花生果种皮特异表达基因AhPSG13的克隆和表达研究

为了克隆在花生果种皮中特异表达的基因,本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出一个277bp的EST序列并进行研究,通过构建花生果皮全长cDNA文库,获得此目的基因G13的全长为1369bp,开放阅读框从第28个碱基始至1122个碱基止,预测分子量为39865.59,等电点5.73。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白具有4个跨膜结构域和多个活性位点,可能与细胞内DNA转录有关;该蛋白与多种豆科作物的半胱氨酸蛋白酶具有较高同源性,推测为花生半胱氨酸蛋白酶相关基因;RT-PCR研究该基因表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,于30d果皮中表达量最大。本研究克隆的AhPSG13基因序列已经登陆到GenBank,登录号为FJ475061。     

嗜热果糖苷酶的基因克隆及表达优化

从嗜热菌Thermotoga neapolitana DSM4359得到嗜热果糖苷酶基因片段,以p ET-28a(+)为表达载体,在Escherichia.coil BL21(DE3)中高效表达。由SDS-PAGE检测可得构建后嗜热果糖苷酶的分子量约为60 KDa。通过单因素试验和响应面法对该嗜热果糖苷酶的产酶培养基进行优化选择,最终确定最佳产酶培养基为:蔗糖10.11 g/L,硝酸铵12.30 g/L,安琪酵母浸粉FM905 8.24 g/L,MgSO_4·7H_2O 5.61 mmol/L,NaCl 10 g/L。相比优化前,经优化后的培养基所产嗜热果糖苷酶酶活提高了近2.1倍。达到了提高嗜热果糖苷酶表达量的目的。     

甘蓝型油菜12种主要性状与产量的关系

以２０个品种为材料进行田间试验，考察主要性状，分析性状间的关系，结果表明：单株产量与全株有效角果数，第一，二次有效分枝数，析高，角果密度有全株有效角果数与第一，二次有效分枝数极显著正相关株型性状间，只株高与主花序长达显著正相关株型性状与产量性状间，株高与主花序角果数 第一，二次有效分枝数分别呈极显著正相关和负相关。因此，油菜高产育种应在增加全株有效角果数，第一，二次有效分枝数基础上，选择植株高，角     

普通烟草NtIAA13b基因的克隆及功能分析

为探究生长素诱导相关基因NtIAA13在烟草钾吸收与利用中的作用,以烟草K326的cDNA为模板,克隆了一个全长879 bp,编码292个氨基酸的基因,并将该基因命名为NtIAA13b。采用qRT-PCR和亚细胞定位等生物技术对NtIAA13b基因在不同组织和不同非生物胁迫条件下的表达特性进行分析,通过转基因技术获得NtIAA13b基因过量表达株系并验证其生理功能。结果表明,NtIAA13b基因所编码的蛋白质相对分子质量为31.71 kD,理论等电点（pI）为6.48。NtIAA13b基因的启动子区包含生长素响应元件TGA-element、赤霉素响应元件P-box和参与厌氧诱导的调控元件ARE等。亚细胞定位的结果显示,该蛋白定位于细胞核。系统进化树结果表明,NtIAA13b和番茄SlIAA13亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,NtIAA13b基因在根中的表达水平最高,其次为茎,叶中表达水平最低。在正常供钾条件下,过量表达株系叶片的钾含量极显著增加。NtIAA13b基因与烟草响应低钾胁迫有关,可能参与了烟草钾的吸收与利用。     

甘蓝型油菜耐湿性初步评价和主成分分析

以发芽种子缺氧处理后幼苗耐湿性状为指标,初步评价了60份不同来源甘蓝型油菜耐湿性,并对各指标进行主成分分析和二维排序分析。结果表明：种子缺氧处理严重抑制油菜幼苗的生长,不同甘蓝型油菜耐湿性差异明显且存在广泛的遗传变异;相关分析表明,相对活力指数与相对成苗率、相对根长、相对茎长、相对鲜重、相对含水量呈极显著正相关,与电导率呈极显著负相关。主成分分析筛选出幼苗活力因子、幼苗恢复生长因子、细胞膜稳定性因子等3个对耐湿性贡献较大的主成分,它们对耐湿相关信息的累积贡献率达87.33%。根据相对活力指数大小和二维排序一致结果筛选出1份来自重庆和3份来自德国的强耐湿性甘蓝型油菜品种。