PCR 方法检测河豚鱼的引物筛选及反应体系优化

根据Genbank 公布的河豚鱼细胞色素b 基因序列,应用软件Primer Premier 5.00 版设计了7 对引物,经过PCR 筛选,确定可以在所有8 个供试河豚鱼样品中检出目的DNA 片段的引物HT-1,用于建立河豚鱼的PCR 检测方法。对该PCR 方法中6 个因素包括退火温度、Mg2+ 终浓度、Taq DNA 聚合酶用量、dNTPs 终浓度、引物终浓度和模板DNA 用量进行优化,确定优化的PCR 扩增体系：10 × PCR 缓冲液2μL,MgCl2 终浓度1.5mmol/L,Taq DNA 聚合酶1.0U,dNTPs 终浓度300μmol/L,引物终浓度0.2μmol/L,DNA 模板400ng,加纯水至总体积20μL。扩增程序定为94℃预变性5min,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,40 个循环,72℃延伸5min。据此建立河豚鱼成分PCR 检测方法,并通过河豚鱼与非河豚鱼的PCR 检测结果比较,验证了该方法的河豚鱼特异性。研究结果还表明,该方法的检出限为0.1%,含量为0.1% 的河豚鱼样品PCR 检出率至少在97.5% 以上。     

沙门氏菌DNA提取及PCR反应条件的优化

分别采用煮沸法和CTAB/NaCl法提取沙门氏菌及对照菌株的基因组DNA,紫外测定和电泳结果表明CTAB/NaCl法提取到的DNA的浓度和纯度较煮沸法理想。合成分别扩增沙门氏菌属特异基因hut基因(495bp)、hilA基因(490bp)、invA基因(284bp)和hns基因(152bp)的引物,对PCR反应条件进行了优化。结果表明可同时用于这四种基因检测的PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性40s,60℃退火40s,72℃延伸50s,40个循环;72℃延伸5min。     

烟草SSR反应体系的优化

以烤烟品种NC2326、G28及其F1为材料,研究了烟草SSR分析中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。结果表明:在总体积为20μL的PCR反应中,含20ng模板DNA,1.5U TaqDNA聚合酶,MgCl2终浓度为1.5mmol.L-1,dNTPs浓度为200μmol.L-1,引物浓度为0.25μmol.L-1时效果较好。     

4组鱼类DNA条形码引物的筛选与优化

目的通过对DNA条形码氧化酶亚基I基因(cytochrome oxidase subunit I,COI)的4组常用引物进行比较筛选,选择适于舟山鱼类鉴定的最佳引物。方法以舟山主产大黄鱼、小黄鱼、带鱼和乌贼样品DNA为模板,对4组常用DNA条形码引物进行PCR体系优化。通过比较PCR产物量、特异性、灵敏度和测序成功率,综合分析筛选最佳引物组。结果 4组引物均能扩增大黄鱼、小黄鱼和带鱼的DNA,对于乌贼DNA的扩增具有明显差异。COI优化引物具有易于扩增、测序简单等优势,更适于作为海产品鉴定的DNA条形码引物。结论本研究为舟山海产品的市场监管和实验室大量样品检测提供了技术参考。     

扩展青霉DNA提取及PCR检测条件的优化

研究扩展青霉DNA的提取及其聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测条件的优化。分别采用玻璃珠法、氯化苄法、玻璃珠+氯化苄法提取扩展青霉菌及对照菌株的基因组DNA,经紫外测定和电泳检测实验,分析提取DNA的质量浓度和纯度;同时,根据扩展青霉多聚半乳糖醛酸酶基因内一段保守序列设计合成一对288bp的扩增引物,并对PCR检测条件进行优化。结果表明：玻璃珠+氯化苄法提取到的DNA质量浓度和纯度较理想,扩展青霉DNA可获得良好的特异性扩增,PCR扩增的最适退火温度为53～59℃,最适引物浓度为0.04～0.16μmol/L,最适模板质量浓度为2.40～5.28μg/mL,dNTPs浓度对PCR扩增影响不大。运用实验所得优化参数检测扩展青霉菌,整个过程仅需3～4h,和传统的培养检测法相比,该方法可有效提高检测效率,可进一步将该方法应用于实践。     

桑黄DNA提取及RAPD反应体系的优化

以桑黄菌丝体为实验材料,采用CTAB法与SDS法提取DNA,并对RAPD反应体系进行优化。结果表明,应用CTAB法提取的DNA纯度和完整性较好,在此方法上建立了桑黄RAPD反应最佳体系(25μL):模板DNA1.0μL,引物0.8μL,dNTPs0.6μL,Taq聚合酶0.3μL,Buffer2.5μL,ddH2O19.8μL,并通过正交实验验证了该反应体系的稳定性和通用性。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,40℃退火1min,72℃延伸1.5min,45个循环,72℃最终延伸5min。      

桑黄DNA提取及RAPD反应体系的优化

以桑黄菌丝体为实验材料,采用CTAB法与SDS法提取DNA,并对RAPD反应体系进行优化。结果表明,应用CTAB法提取的DNA纯度和完整性较好,在此方法上建立了桑黄RAPD反应最佳体系(25μL):模板DNA1.0μL,引物0.8μL,dNTPs0.6μL,Taq聚合酶0.3μL,Buffer2.5μL,ddH2O19.8μL,并通过正交实验验证了该反应体系的稳定性和通用性。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,40℃退火1min,72℃延伸1.5min,45个循环,72℃最终延伸5min。     

烤后烟叶多重PCR反应体系的优化

以烤烟品种中烟100为模板,利用两对SCAR引物,采用单因素和正交优化试验,研究烤后烟叶多重PCR反应体系中各主要因素的影响情况,建立了适合烤后烟叶多重PCR扩增的最佳反应体系:20μL体系中含模板DNA 45 ng,Mg2+浓度2.50 mmol/L,d NTP浓度0.40 mmol/L,Taq酶用量4.00 U.该体系多重扩增条带清晰,可缩短鉴别时间,为利用多重PCR技术鉴别烤烟DNA指纹图谱奠定了基础.     

烤后烟叶SSR反应体系的优化研究

以烤烟RG11品种为原料,研究烤后烟叶简单重复序列(SSR)分析中聚合酶链式反应(PCR)体系各主要因素及其之间的相互作用对SSR扩增的影响,结果表明:烤后烟叶SSR-PCR反应最佳体系为20μL体系中含35 ng模板DNA,1.5 U TaqDNA聚合酶,2.375 mmol/L MgCl2,0.6 mmol/L dNTPs和0.4μmol/L引物.     

烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）SRAP-PCR 体系建立及优化

采用烟草靶斑病菌YC-9, LJT-8和QYS-7为DNA模板,初步筛选SRAP引物组合;采用L16(45)正交试验设计,对烟草靶斑病菌的SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs, Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板浓度等5个因素进行优化试验。结果表明:共筛出13对扩增条带清晰且多态性好的引物组合;烟草靶斑病菌的最佳SRAP反应体系为Mg2+浓度2.0 mmol/L、dNTP浓度200μmol/L、Taq DNA聚合酶0.8U、引物浓度140 mmol/L、模板DNA 20 ng及1×PCR buffer,反应总体积为20 μL;各因素对SRAP-PCR扩增反应结果影响的差异较大,依次为Taq DNA聚合酶>引物> Mg2+> dNTPs=模板DNA。      

基于PCR技术的肉类成分溯源鉴定方法研究进展

近几年屡屡曝光的食品安全事故引起了社会的广泛关注,食品安全已经成为社会共同关注的问题,肉类掺假造假现象更是层出不穷,其中用低价鸡肉、鸭肉、猪肉等掺入、冒充牛羊肉成为主要的掺假方式。国内外进行肉类掺假鉴定主要以核酸作为靶标,核酸鉴定也是物种鉴别最常用、最核心的方法,以DNA检测为基础建立起来的DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR、荧光探针等技术也得到空前发展和广泛应用。我国针对动物源性成分检测也制定了相关国家标准和行业标准,但大多现行标准中基于DNA检测建立的PCR技术只能检测单一物种,滞后于技术的发展。目前,基于PCR发展起来的衍生技术凭借其高灵敏度、强特异性和高通量等优势在动物源性成分检测工作中显示出巨大潜力,也是肉类成分鉴定未来的重要方向。本文综述了PCR技术在肉类检测中的研究概况和现行标准的技术概况,以期为肉类成分鉴定研究提供信息。     

基于Web的高校学生选课系统的新设计

设计了基于Web的高校学生选课系统.该系统采用B/S三层结构、中间件技术以及大型关系型数据库管理系统,基本实现了高校学生选课的自主化.系统采用多级权限设置、使用触发器等措施来保证数据的安全性和一致性,具有一定的实用价值.     

基于免疫磁分离-双重荧光定量PCR的鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测

目的使用免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法实现对鲜猪肉中金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的同时、快速检测。方法在37℃的条件下,利用特异性免疫磁球从250 m L循环体系中快速、有效地捕获目标菌。再通过特异性的引物与探针,对沙门氏菌和志贺氏菌进行双重荧光定量PCR检测。结果本研究方法针对鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测限分别达到3.4 cfu/g和9.4 cfu/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度均达到100%。此外,通过对30组实际样品的检测,该方法与传统标准方法的结果保持一致。结论本研究建立的免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法比国标方法更快速和高效,适用于鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测。     

氨基化磁性纳米粒子捕获基因组DNA结合PCR快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌

本研究对氨基化磁性纳米粒子进行优化,再用优化后的纳米粒子分离牛奶样品中微量的金黄色葡萄球菌基因组DNA,结合PCR检测,可以达到100 CFU/m L的检测限。在此过程中,纳米粒子与DNA的复合物直接加入到PCR体系中进行检测,无需洗脱、纯化等步骤,这样既减少了操作步骤,也减少了DNA损耗,还起到了浓缩的作用。而且,此方法中纳米粒子无需抗体等生物分子标记,成本非常低廉,在生命物质的快速检测中具有广阔的前景与巨大的潜力。      

基于人工智能的配棉与纱线质量预测系统的设计与实现

论述了基于人工智能的配棉与纱线质量预测系统软件的设计思想,研究了B/S结构模式下,将数据层、业务逻辑层和表示层进行封装和分离的数据保护问题。探讨了综合计算机软件和人工智能算法等多种关键技术来实现计算机自动配棉和纱线质量预测等多种功能的方法,并在ASP.Net开发平台中实现了MVC架构模式。     

基于web结构的客户端子系统在模具选材专家系统中的应用与研究

通过对客户端组件技术的探索，提出一种基于web结构的模具选材专家系统的解决方案，并利用DcOM技术及客户端组件技术和Inprise Delphi开发工具实现了该客户端的功能。