小菜蛾moricin在毕赤酵母中的表达及抑菌活性分析

抗生素的过度使用给自然生态带来诸多不利影响,寻找合适的抗生素的替代物,从而减少抗生素的使用正成为当下的研究热点。以来自于小菜蛾的特异性抗菌肽moricin为研究对象,研究其酵母异源表达水平和抑菌性能及生化特性,为进一步的开发利用提供理论支持。根据已有的小菜蛾抗菌肽moricin特异性基因信息,采用聚合酶链式反应扩增其成熟肽基因mor-3,并克隆至pGAPZαA质粒中,构建组成型分泌表达载体pGAPZαA-mor3,线性化片段电转化导入毕赤酵母SMD1168菌株,高质量浓度Zeocin筛选获得高拷贝重组转化子。以YPD为培养基进行摇瓶发酵,重组蛋白获得高效表达,分子质量约为5kD,与理论预测的基本一致;发酵60 h,上清液中重组蛋白表达量达248.98 mg/L,而且耐热性能良好,同时具备较强的耐强酸及强碱的能力,特别在强酸环境中活性保持稳定,体现了较好的机体内环境的适应性潜力;对部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抑菌作用,特别是对革兰氏阴性菌具备特异性较强的抑制作用,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为6.25μg/mL,而对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度仅为124.49μg/mL。独特的抑菌性能和理化特点,使其具备广阔的开发应用前景及良好的社会与环保效益。     

杂合抗菌肽MgJ基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定杂合抗菌肽MgJ基因的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPICZαA-MgJ经SacⅠ线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）扩增验证,甲醇诱导表达。优化杂合抗菌肽MgJ诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌体浓度表达条件。结果表明杂合抗菌肽MgJ的最佳表达条件为：28 ℃、250 r/min诱导培养,每24 h添加体积分数0.5%的甲醇,诱导时间120 h,MgJ表达量可达11.9 mg/L。纯化后获得的表达产物MgJ对S. aureus ATCC 29213有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）为10 μg/mL。     

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的优化表达及疫苗活性研究

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要致病原,在全世界范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)是制备猪蓝耳病疫苗的主要靶蛋白。针对目前PCV2疫苗生产工艺复杂、成本较高的问题,本研究利用毕赤酵母表达系统研究PCV2-Cap蛋白的重组表达及疫苗活性,将PCV2-Cap基因序列去除核定位信号序列(NLS)后,经密码子偏好性优化,构建重组表达载体,并转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经Zeocin抗性筛选获得重组菌株。SDS-PAGE和Western blot结果显示Cap蛋白在酵母表达系统中成功表达,蛋白质大小为26 ku。5 L罐高密度发酵小试,得到PCV2-Cap蛋白在发酵上清液中的浓度约为0.53 mg/m L,占总蛋白的23.5%。动物免疫试验显示重组Cap蛋白能刺激机体产生特异性抗体。结果表明,PCV2-Cap基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,为PCV2-Cap毕赤酵母亚单位疫苗的研制提供了数据支持。     

杂合抗菌肽NK-LPd的设计、表达及抑菌活性评价

目的：了解杂合抗菌肽NK-LPd的抑菌活性,探讨进一步开发潜力。方法：用两个甘氨酸作接头连接NK-lysin和Piscidin的活性片段,生物信息学技术预测杂合抗菌肽的理化性质和功能结构,根据毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性优化杂合抗菌肽NK-LPd基因序列,重叠延伸聚合酶链式反应（gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction,SOE-PCR）扩增基因并与分泌型表达载体pPIC9K连接,通过化学法将其转化至毕赤酵母KM71感受态细胞中,经0.5%甲醇诱导表达和亲和纯化后获得杂合抗菌肽NK-LPd,评价其抗菌活性。结果：成功构建了KM71/pPIC9K-NK-LPd,经诱导表达5 d后上清液中获得了相对分子质量约6 kDa的表达产物,与预期大小相符;抗菌活性实验表明,NK-LPd对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较强的抑菌活性,与母体肽相比,杂合抗菌肽NK-LPd的抑菌活性显著增强。结论：设计并在毕赤酵母KM71中分泌表达了杂合抗菌肽NK-LPd,其抑菌活性优于母体肽。本研究可为新型杂合抗...     

人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。     

抗菌肽DCD-1L的随机突变及在毕赤酵母中的表达

目的用毕赤酵母构建抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并使随机多肽在培养基中表达。方法用定向进化的方法在基因内部造成随机突变,然后将其构建到含有强启动子GAP和α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pGAPZαC中,线性化后转化到巴斯德毕赤酵母蛋白酶缺陷株SMD1168中,形成突变库。利用抗生素Zeocin筛选出阳性克隆,并用SDS-PAGE鉴定表达蛋白质。结果肽库库容达到7．8×10^3个cfu,在上清中鉴定出了表达蛋白。结论成功构建了抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并实现了在培养基上清中的表达。     

新型生物防腐剂——多聚阳离子抗菌肽在毕赤酵母中的表达

在毕赤酵母GS115中表达一种新型食品生物防腐剂——多聚阳离子抗菌肽(poly-cationic antibacterialpeptide,PCAP)。根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成编码多聚阳离子抗菌肽与多聚阴离子肽融合肽的DNA序列,连接并克隆入酵母表达载体pPIC9,得到重组表达质粒pPIC9-PCAP,并转化至毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆子,用体积分数0.5%的甲醇诱导表达,优化表达条件,表达产物用Tricine-SDS-PAGE分析,在分子质量8kD左右处可见目的蛋白表达条带,表明融合肽成功地在毕赤酵母中分泌表达。在pH2.0条件下将表达产物采用胃蛋白酶酶解,分离得到的碱性多聚阳离子肽对食品腐败微生物枯草芽孢杆菌具有明显的抑菌作用。     

非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

用PCR 方法从E.coli BL21(DE3)中获得麦芽糖转糖基酶基因,将该基因插入到酵母表达载体pPIC9K 的α分泌信号开放阅读框的下游,对重组质粒pPIC9K-MalQ 所含的外源片段进行双向测序。将测序正确的重组质粒用内切酶Sal Ⅰ线性化,电穿孔转化到GS115 感受态细胞中,G418 梯度筛选高拷贝转化菌及PCR 鉴定目的基因的整合,1% 甲醇诱导表达。经薄层色谱分析粗酶液处理的麦芽二糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性。     

酵母分泌表达重组人神经生长因子

目的研究人神经生长因子基因工程制备工艺。方法构建了表达质粒pPIC9K/rhNGF,转化毕赤酵母,筛选多拷贝转化子,进行摇瓶表达,正交试验选择表达条件。结果得到高表达高外泌的工程菌,并确定了纯化步骤,经疏水层析和阳离子交换层析纯化后,取得高活性高纯度的rhNGF。结论为该药的规模生产奠定了基础。     

牛乳铁蛋白肽衍生物的设计及其在毕赤酵母中表达与活性分析

本文利用抗菌肽数据库以及蛋白质分析软件等工具,根据抗菌肽结构与功能的关系,对牛乳铁蛋白肽衍生肽(LfcinBD)的结构进行优化设计。将设计得到的LfcinBD基因片段与pPIC9K质粒构建重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母细胞GS115,利用甲醇诱导表达。实验对发酵上清液进行了分离纯化和活性测试,SDS-PAGE电泳检测到了目标蛋白的有效表达。实验还对优化设计得到的牛乳铁蛋白肽衍生肽与同等发酵条件下产生的天然牛乳铁蛋白肽的抑菌活性进行了对比分析,结果证明该衍生肽对金黄色葡萄球菌有更强的抑菌活性。研究表明经色氨酸Trp替换的牛乳铁蛋白肽中第10,14位氨基酸获得的牛乳铁蛋白肽衍生肽具有很好的抑菌活性,实验为进一步探究牛乳铁蛋白肽衍生肽生物活性的改进奠定了基础。     

重组牙鲆生长激素基因片断在毕赤酵母中的表达

为了开发一种有效的重组牙鲆生长激素(r-fGH)的方法,利用PCR的方法从牙鲆eDNA文库中克隆得到了牙鲆生长激素(fgh)的cDNA片断.接着将这个fgh片断克隆到整合型质粒pAO815,它可以在甲醇诱导启动子的调控下表达外源蛋白.利用这种包含一个fgh插入片段的克隆来构建含有2个和3个头尾顺序排列的fgh表达框的表达质粒.利用氯化锂转化的方法将所构建的质粒转化到毕赤酵母GS115,然后进行筛选、培养和0.5%甲醇诱导表达,最后得到重组表达的牙鲆生长激素.     

杂合抗菌肽Me-HNP1真核表达载体的构建与初步表达

选择蜂毒肽(Melittin)和人体防御素(HNP-1)部分基因序列进行人工融合,通过生物信息学技术预测其理化性质和功能结构,依据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏爱性原则编码杂合肽Me-HNP1基因,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增目的基因并定向克隆至穿梭型表达载体pPICZa A上,将构建成功的分泌表达载体pPICZαA-Me-HNP1通过电转化的方式转化到毕赤酵母感受态细胞GS115内,以甲醇为诱导剂进行诱导表达,将得到的粗蛋白进行分离纯化。Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳在5 kDa处得到一条单一清晰条带,表明杂合抗菌肽Me-HNP1在毕赤酵母中成功表达,生物信息学分析得出杂合抗菌肽Me-HNP1分子内带有8个正电荷,等电点为9.55,脂溶性80.44,在酵母体内半衰期大于20 h。表明其具有成为优秀抗菌肽潜力。为抗菌肽的研究奠定了实验基础。     

荧光素酶表达载体构建及其在巴斯德毕赤酵母的表达

萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,FL)是ATP快速检测技术的核心组件,通过荧光强度与ATP浓度的对应关系,在食品行业检测微生物数量发挥着重大作用。本文为实现荧光素酶在重组毕赤酵母GS115中的异源表达,通过从载体pGL2-control中扩增荧光素酶基因luc,克隆到真核表达载体p PIC9K中,线性化后电击转化毕赤酵母GS115菌株,筛选阳性重组菌株。在甲醇的诱导下进行酶的表达,对粗酶液进行生物活性发光分析,然后对粗酶进行超滤、阴离子层析和分子筛凝胶层析三步纯化。甲醇诱导表达96 h发现胞外和胞内粗酶液均有相对较高的酶发光活性,酶活分别为1.45×10~6 RLU/mL和1.58×10~9 RLU/mL。SDS-PAGE与Western blot分析重组荧光蛋白大小约为70 ku,最终纯化得到的荧光素酶,其比活为7.0×10~8 RLU/mg,纯化倍数达到19.3倍,产量为48 mg/L。以上结果表明,荧光素酶能够在毕赤酵母表达系统获得较好的表达和纯化效果。     

重组枯草芽孢杆菌素subtilosin A基因的合成及其在毕赤酵母中的表达

人工改造并合成subtilosin A的结构基因（rsbo A）,并在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白。结果表明:经阳性大肠杆菌转化子菌落PCR和测序鉴定,表明重组质粒p PIC9K-sbo构建正确;经阳性酵母转化子的菌落PCR产物电泳检测,可见清晰目的基因条带,证明重组酵母GS115-p PIC9K-sbo构建正确;经枯草芽孢杆菌素蛋白电泳检测,可见明显蛋白条带,表明重组rsbo A基因在毕赤酵母GS115中获得了分泌表达。在抑菌效果检测中,重组酵母工程菌的发酵液对铜绿假单胞菌具有一定的抑菌活性。本研究开创了有望替代抗生素的小分子肽细菌素异源表达新思路,为枯草芽孢杆菌素subtilosin A的工业化生产奠定了基础。