一种SUMO-Heparinase Ⅰ融合酶的可溶性表达与纯化

克隆自肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)的肝素酶Ⅰ(Heparinase Ⅰ,EC4.2.2.7)广泛应用于低相对分子质量肝素(LMWH,low molecular weight heparin)制备研究。然而,该酶在大肠杆菌表达体系中易形成包涵体,限制了其大量应用。将可溶性配体SUMO(small ubiquitin-like modifier,小泛素类似修饰蛋白质)与C端带有6×His标签的肝素酶基因片段N-端融合表达,菌体总蛋白质和可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳表明,N端融合SUMO的肝素酶Ⅰ可溶性表达比率显著提高;通过镍-亲和柱层析得到均一纯化的融合肝素酶Ⅰ,融合酶酶学性质表明该融合酶可直接应用于肝素降解而无需切除SUMO标签,为肝素酶Ⅰ的广泛应用提供了良好的技术基础。     

重组融合蛋白MBP-BSH 在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定

选择IF2融合标签,另选择含SUMO、GST、NusA和MBP融合标签的质粒构建表达载体。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Escherichia Rosetta(DE3) (pLS932-BSH)的诱导表达细胞提取液上清出现了明显的融合蛋白MBP-BSH条带,经诱导表达条件优化后,MBP-BSH可溶性大幅度提高。用Ni-NTA Resin和Amylose Resin分别进行目标蛋白纯化,结果显示前者效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的酶比活力为2.4282U/mg。     

His-tag对亚油酸异构酶在大肠杆菌中可溶性表达的影响

为了研究6×His-tag对来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶(PAI)可溶性重组表达的影响,我们构建了三种大肠杆菌重组菌株,表达了三种重组PAI:C端带有His-tag亲和标签、N端带有His-tag亲和标签和不加His-tag亲和标签。通过SDS-PAGE和Westernblot分析重组蛋白表达情况,并利用气相色谱检测酶活。实验结果表明:在相似的诱导表达条件及生长状态下,三种大肠杆菌重组菌株均成功表达了具有亚油酸异构酶活性的重组蛋白质,三种重组PAI的表达总量相当,6×His-tag的融合表达促进了PAI蛋白质包涵体的形成,而C端6×His-tag带来的影响最大。     

栓菌漆酶的异源表达及重组酶碳端和氮端组氨酸标签修饰对酶学特性的影响

以来源Trametes sp.C30 的LAC3漆酶基因为研究对象,通过引物设计进行突变,在其C端和N端进行延长,分别引入6 个组氨酸标签,并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中,将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性质的影响较大。C端引入组氨酸标签的重组酶的表达量不受影响,但是在N末端引入组氨酸标签的重组酶表达量只有LAC3的一半。添加组氨酸标签的融合蛋白对ABTS和SGZ两种底物的亲和力得到增强。而在酸碱稳定性耐受方面,与LAC3相比,N末端氨基酸的改变使其在酸碱稳定性方面得到了增强,中碱性条件下仍能保持较佳活性。C端和N端可塑性的研究对于漆酶新性状的获得具有重要意义。     

应用不同载体探索环二肽合成酶AlbC的高效可溶性表达

AlbC是一种环二肽合成酶，可用于合成具有抗菌性和抗肿瘤性的环二肽及后续衍生物。近年来，AlbC的产物在白酒及其副产物黄水中被相继检出，对赋予白酒健康功能起着至关重要的作用。为实现albC基因的高效可溶性表达，本研究以实验室保藏的枯草芽孢杆菌Y1为模板克隆出albC基因，构建了pQE30-albC,pET28a-albC,pET28a-SUMO-albC,pGEX-6P-1-albC 4个重组质粒，并探究了不同诱导温度下每个重组质粒的诱导表达情况。结果表明：（1）pQE30-albC不表达或者表达量低；pET28a-albC正确表达，但表达量和可溶性表达量都较低，纯化后融合蛋白浓度为1.0 mg/L;pET28aSUMO-albC正确表达，且实现可溶性表达，纯化后融合蛋白浓度为30 mg/L，切除SUMO标签蛋白后浓度为22 mg/L;pGEX-6P-1-albC正确表达，且实现可溶性表达，纯化后融合蛋白浓度为44 mg/L，切除GST标签蛋白后浓度为34 mg/L;(2)拥有GST促溶标签的pGEX-6P-1载体是4组载体中达到albC基因可溶性表达水平最高的载体；（3）在4种载体中...     

Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌途径的鉴定及其分泌能力的提高

食品安全（GRAS）菌株枯草芽孢杆菌由于其具有良好的分泌表达能力及易于基因工程操作等特性被广泛用作外源蛋白质的表达菌株。枯草芽孢杆菌中蛋白质的分泌大多依赖于信号肽介导的Sec分泌途径（General secretion pathway）和Tat分泌途径（Twin-arginine translocation pathway）。在本研究中,通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现来自于Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌并不依赖信号肽,该酶通过非经典蛋白质分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌。通过信号肽筛选,发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SP_phoD,并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶（catalase,CAT）。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx．HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

重组大肠杆菌生产多形拟杆菌肝素酶I的发酵优化

以实验室前期构建的N端融合SUMO标签的多形拟杆菌肝素酶I(SUMO-Bt-Hep I)生产菌株重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/pE-SUMO-Bt-HepI为研究对象,通过单因素确定其最佳表达条件:诱导温度25℃、诱导剂浓度0.4 mmol/L、诱导时间12 h;首先通过Plackett-Burman试验,筛选出培养基中3个主要影响酶活的因素:葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨。并通过响应面试验确定最佳培养基为:葡萄糖9.52 g/L,酵母提取物9.61 g/L,蛋白胨19.92 g/L,硫酸铵4 g/L,磷酸氢二钠18 g/L,磷酸二氢钾3 g/L,硫酸镁5 g/L。在此最佳培养基下发酵酶活预测可达55133IU/L,3次验证试验获得的SUMO-Bt-HepI酶活力平均为56961 IU/L,与理论预测值接近,比优化前(24215.9 IU/L)提高了2.3倍。通过5 L发酵罐的分批补料扩大培养得到的最高发酵酶活为3.937×10~5IU/L,比摇瓶提高了6.91倍,这是目前报道发酵生产肝素酶I的最高水平,对工业化应用具有一定的指导意义。     

米黑霉脂肪酶基因的高效表达及活性测定

为了实现米黑霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase,RML)基因在大肠杆菌中的高效表达,并得到大量的具有生物活性的脂肪酶,首先通过3种方式提高RML在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量:1)低温诱导(16℃)RML表达;2)新型分子伴侣(Skp)与RML N端融合表达;3)载体pET32a上的Trx·tag与RML N端融合表达.其次对各蛋白质进行纯化及活性测定,各种条件得到的RML比活在(226±10～247±10) U/mg.蛋白质表达结果显示:经低温诱导RML的效果最好,纯蛋白质量浓度为0.86 mg/mL,表明诱导温度是影响可溶性蛋白质表达量的关键因素;活性测定结果表明,Skp和Trx· tag与目的基因N端的融合没有影响RML活性中心(C末端)对底物的结合和催化能力.因此,RML不仅在大肠杆菌中得到高效表达,并且保持原有生物学活性,在工业生产中有应用价值.     

人源β-N-乙酰葡糖胺转移酶I（h-GnT-I）的原核表达与活性鉴定

-β--N-乙酰葡糖胺转移酶I（-h-GnT-I）功能为在高尔基体中向糖蛋白上的N-寡糖M5GN2结构添加一个-β--1,2 连接的N-乙酰葡糖胺。为大量获得具有活性的-h-GnT-I蛋白,构建了重组表达质粒pET28a-MGAT1?驻TM并将其在大肠杆菌Rosetta菌株中表达。对诱导条件进行优化后,将获得的可溶性重组蛋白His-hGnT-IΔTM进行镍柱亲和纯化并通过高效液相色谱（HPLC）检测其体外活性和底物特异性。结果表明,大肠杆菌ROSETTA体系可以成功表达可溶性重组hGnT-I蛋白;该蛋白质相对分子质量约为42 800,在体外反应中具有相应的糖基转移酶活性;除天然糖链底物M5GN2外,该蛋白质可以识别非天然糖链底物M3GN2;产物经酶切反应验证,证明该蛋白质催化添加一个β糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺的反应。本研究所开发的原核表达体系可以大量制备纯化的功能性重组hGnT-I蛋白,以应用于该蛋白质的性质研究以及N-糖链的体外合成。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK原核表达、纯化及溶液构象分析

金黄色葡萄球菌K型肠毒素（Staphylococcus aureus enterotoxin K,SEK）由金黄色葡萄球菌肠毒素基因簇编码,流行病学显示,编码SEK蛋白的sek基因在食品源金黄色葡萄球菌菌株中具有较高的检出率,说明SEK也可能是一种重要的食品中毒潜在致病因子。本研究将截去N端信号肽的SEK蛋白编码基因与原核表达载体pET-28a（＋）连接,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-ΔNspsek;通过对sek基因在不同原核表达宿主菌中的表达及表达条件优化分析,确立SEK蛋白的最优表达条件;利用镍亲合层析纯化含组氨酸（His）标签的SEK融合蛋白,将凝血酶切除His标签后的SEK蛋白进行聚合状态及热稳定分析、荧光发射谱和圆二色谱分析。结果表明,重组蛋白SEK表达成功,热处理导致蛋白部分降解;荧光光谱揭示SEK蛋白在278?nm和295?nm波长处具有相同的最大色氨酸发射峰;344?nm波长处表明SEK蛋白处于紧密折叠的天然状态;圆二色谱分析表明,ΔNspSEK重组蛋白富含β-折叠（23.6%）、β-转角（28%）以及α-螺旋（29.1%）等二级结构。为深入研究SEK蛋白的结构与功能提供基础,也对改进食品加工工艺和提高食品安全具有指导意义。     

小鼠核糖核酸酶抑制剂异源高效可溶性表达、纯化及活性研究

为获得高效可溶性表达的小鼠核糖核酸酶抑制剂(MRNI),本文通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和 MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,利用MagNi磁珠检测及电泳分析MRNI的表达状况,并对其培养温度及时间进行优化,同时,与其他公司核糖核酸酶抑制剂(RI)活性进行对比。结果表明,重组菌BL21(DE3)(pNBEⅡ-MRNI)诱导表达的可溶性融合蛋白IF2-MRNI的产量最高,最适诱导条件为37 ℃,诱导培养6 h,20 ℃培养24 h。磁珠纯化后获得的融合蛋白IF2-MRNI浓度为3621.3 mg/L,检测其酶活性约为40 U/μL。该酶具有抑制RNase A活性,防止RNA被降解的作用,为RI的生产及应用提供理论基础。     

氨基甲酸乙酯水解酶可溶性表达及其酶学性质研究

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)是一种主要存在于发酵食品和酒精饮料中对人体有潜在致癌性的有害物质,EC水解酶能够有效地消减EC,但其存在异源表达量较低、乙醇耐受性较差等问题。该研究结合计算机辅助改造与基于机器学习的融合标签设计等手段对赖氨酸芽孢杆菌来源的EC水解酶进行改造及优化。首先利用PROSS计算程序改造EC水解酶提高其乙醇耐受性,其次基于支持向量机回归的机器学习模型设计促溶标签提高其可溶性表达。基于PROSS筛选获得了组合突变体S21E/H197Y/Q328C/P348I(EC4),其酶活力相较于野生型提高了1.55倍,20%(体积分数)乙醇条件下的相对酶活力较野生型提高了约2.56倍。进一步筛选了合适的短促溶标签获得可溶性表达提高最多的是SVM1-EC4,其酶活力约为野生型的1.82倍,15%(体积分数)乙醇下的相对酶活力是野生型的3.99倍,且在模拟酒样中水解EC效果是野生型的2.07倍。总之,计算与融合标签相结合对EC水解酶进行改造能够有效地提高其可溶性表达及乙醇耐受性,为其工业应用提供了一定的理论依据和技术基础。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx-HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

空肠弯曲菌β1,3-半乳糖基转移酶（CgtB）突变体的设计及活性鉴定

来自于空肠弯曲菌的β1,3-半乳糖基转移酶（CgtB）主要负责蛋白质O-连接糖基化的第二步延伸，在O-连接N-乙酰半乳糖胺（O-GalNAc）修饰后面添加一个半乳糖，目前CgtB已经被广泛应用于体外O-连接糖基化的合成。为了开发O-GalNAc修饰的识别工具，CgtB蛋白质用于突变体设计。在基因水平删除N端30个氨基酸及C端的30个氨基酸得到Cgt1，将Cgt1构建在pMal-c5x表达质粒上并通过大肠杆菌进行原核表达。可溶性的Cgt1经过麦芽糖结合蛋白（MBP）亲和层析柱进行纯化并利用糖结合实验进行活性分析。结果显示，大肠杆菌体系可以成功表达可溶性重组Cgt1蛋白质，分子量约为70 kDa，重组的Cgt1具备有结合O-GalNAc修饰蛋白质的活性；针对不同的标准糖蛋白，Cgt1只识别含有O-GalNAc修饰的黏蛋白（mucin）；对于复杂的细胞样品，Cgt1可以特异性识别细胞内的O-GalNAc修饰。该研究开发的识别O-GalNAc修饰工具，为进一步研究O-GalNAc修饰的功能奠定了基础。     

硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅱ的高效融合表达及其酶学性质研究

目的:本研究旨在实现硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅱ（chondroitinase ABC Ⅱ,ChSase ABC Ⅱ）的高效可溶性表达并研究其酶学性质,为ChSase ABC Ⅱ在药品和保健食品生产中的应用奠定基础。方法:在优化ChSase ABC Ⅱ基因原始序列的基础上,构建重组质粒pET-28a-His-ChSase ABC Ⅱ并优化其表达条件;利用亲和层析得到带有多聚组氨酸标签（polyhistidine-tag,His-tag）的ChSase ABC Ⅱ融合蛋白后,研究了His-ChSase ABC Ⅱ的部分酶学性质。结果:构建的His-ChSase ABC Ⅱ融合蛋白表达系统能在大肠杆菌中实现可溶性表达;在表达宿主为E.coli BL21(DE3)和诱导剂（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）浓度为125 μmol/L的优化条件下,发酵液酶活力可达到7206.83±184.27 IU/L;纯化后的His-ChSase ABC Ⅱ酶比活力为22.02±0.39 IU/mg蛋白,最适pH和温度分别为7.5和40 ℃,其在30~40 ℃条件下较为稳定,且半衰期在2 h以上。His-ChSase ABC Ⅱ能特异性有效分解硫酸软骨素,其K_m值为10.4±0.8 μmol/L,K_cat值为9.4±0.2 s?1。结论:本论文通过基因优化和融合表达等策略实现了His-ChSase ABC Ⅱ的高效表达和纯化。此外,His-ChSase ABC Ⅱ的酶学性质可基本满足其在医药和营养产品工业生产中的应用需求。     

苹果转录因子MdHB1的原核表达与多克隆抗体制备

HD-Zip转录因子在植物生长发育过程中具有重要作用,蛋白水平的研究有助于进一步阐释其功能。将苹果转录因子基因MdHB1分别连接到pGEX-6p-1和pET-28a（＋）表达载体,热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,随后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导培养,分别得到了带有GST和6×His标签的MdHB1融合蛋白（分别命名为MdHB1-GST和MdHB1-His6）。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,在?18、28?℃和37?℃?3?个温度诱导条件下都是沉淀中MdHB1-GST融合蛋白的量较多,37?℃尤为明显,较低的诱导温度（18?℃和28?℃）能够提高融合蛋白MdHB1-GST可溶性形式存在的比例;28?℃条件下50?mg/L IPTG诱导的总蛋白量在8?h左右达到最大,且受IPTG质量浓度（10、50、100?mg/L）的影响不大。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白MdHB1-His6为抗原,成年兔免疫以制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明,所得抗体效价较高。蛋白质免疫印迹实验结果说明,所制备多克隆抗体特异性良好,能够从菌体和苹果幼叶总蛋白中成功检测MdHB1蛋白。综上所述,本实验所得多克隆抗体能够用于深入研究MdHB1在植物体内的功能。     

水稻密码子优化的cry2A^＊基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化

通过PCR从克隆载体puC18-3Z/Cry2A*上扩增水稻偏爱型密码子优化的抗虫基因cry2A*,经限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切定向插入到原核表达载体pET-28a( ),成功构建了在表达蛋白的N端只带有6个组氨酸标签的融合蛋白表达载体pET-28a( )/Cry2A*,并转入人肠杆菌BL21(DE3)中.通过对其表达条件进行优化,发现在IPTG浓度为0.05mmol/L、诱导时问为3h、诱导温度为20℃的表达条件下目的蛋白大部分以可溶形式进行表达.采用Ni-NTA亲和柱纯化得到高纯度目的蛋白,薄层扫描分析蛋白纯度达到95%.     

大肠杆菌中dAb一级结构与可溶性表达关联

抗体类药物研发是药物发展的一个重要研究方向,目前已有许多抗体在原核表达体系中成功表达。人们通常采用"试错法"优化表达系统,提高蛋白质产量,但该方法费时费力且成功率低,因此迫切需要探索氨基酸组成与蛋白质可溶性表达水平之间的关联,以指导表达系统的选择或蛋白质分子的定向改造。在单域抗体dAb分子的C端末尾添加一个氨基酸,发现单个氨基酸的改变足以引起蛋白质可溶性表达量发生显著变化。通过层次聚类、Cluster Omega对dAb氨基酸序列与表达水平分别进行分类,发现两者分类一致的比例达到70%,证明了氨基酸序列与蛋白质表达水平间的关联。通过对65个CDR随机突变的dAb分子进行线性建模分析其可溶性表达量,发现对dAb胞外质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为S(丝氨酸),R(精氨酸),N(天冬酰胺),D(天冬氨酸),Q(谷氨酰胺),Y(酪氨酸),F(苯丙氨酸),G(甘氨酸),对dAb胞内质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为G,R,C(半胱氨酸),N,S,Y,K(赖氨酸),A(丙氨酸),对dAb蛋白质总量有显著影响的组合为R,S,G,N,Y,C,Q,F,T(苏氨酸)。其中R、S和G的含量显著影响dAb的可溶性表达量且该影响不受分布位置的影响。蛋白质的极性亦是其可溶性表达水平的显著影响因素。     

肝素黄杆菌肝素酶性质的研究

目的研究肝素酶I的理化性质。方法测定肝素酶I的相对分子质量、等电点、紫外吸收光谱、N端序列,以及各种环境因素对酶活性和酶稳定性的影响。结果相对分子质量约为43×103,等电点为8.5。N端序列不能测到。酶的最适催化条件为:温度45℃,pH6.4～7.0,离子强度150mmol/L。酶在35℃以上极易失活,在pH7～11之间基本稳定。该酶的最大紫外吸收位于280nm。H2O2(1mmol/L,10mmol/L),NaN3(10mmol/L,100mmol/L),乙腈(1%,10%),1mol/L盐酸胍和1mol/L尿素对酶的活性无影响;1%SDS,4mol/L盐酸胍和4mol/L尿素则使酶完全失活;CaCl2和MgCl2是该酶的激活剂,FeCl2则对该酶的活性具有抑制作用。结论通过实验,测定了肝素酶I的主要理化性质。