牛坏死杆菌43kDa外膜蛋白真核质粒在BHK细胞中的瞬时表达

目的构建含有牛坏死杆菌43 kDa外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因的真核表达重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,并检测其在BHK细胞中的瞬时表达。方法将43 kDa OMP核苷酸全基因序列与pCAGGS-HA载体连接,构建重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP,转化至大肠埃希菌,将鉴定正确的阳性菌转染BHK细胞,采用间接免疫荧光和Western blot法检测重组蛋白的表达。结果经双酶切及PCR鉴定,重组质粒pCAGGS-43 kDa OMP构建正确;转染pCAGGS-43 kDa OMP的BHK细胞镜下观察可见绿色荧光,Western blot检测可见相对分子质量为43 000的目的蛋白。结论成功构建了pCAGGS-43 kDa OMP真核表达质粒,可在BHK细胞中瞬时表达,为进一步研究牛坏死杆菌感染机制奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。     

犬干扰素α1基因在大肠埃希菌中的表达及其抗病毒活性的测定

目的在大肠埃希菌中高效表达重组犬干扰素α1(canine interferon alpha1,CaIFNα1)基因,并对其抗病毒活性进行初步研究。方法根据大肠埃希菌密码子的偏嗜性,人工合成犬干扰素α1成熟蛋白编码基因,同时引入大肠埃希菌EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,将改造后合成的CaIFNα1核苷酸序列定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-CaIFNα1,并进行PCR及双酶切鉴定;将鉴定正确的重组表达质粒pET-CaIFNα1转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗VSV病毒活性。结果重组表达质粒经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白CaIFNα1相对分子质量约39 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的61.5%,可被鼠抗His单克隆抗体及鼠抗CaIFNα1多克隆抗体特异性识别,在MDCK细胞上呈现较高的抗病毒活性,为2.0×106U/ml。结论已成功改造了CaIFNα1基因,并在大肠埃希菌中实现了高效表达,表达产物具有较高的抗病毒活性。     

牛Ⅱ型链球菌vanB2基因真核表达质粒的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建牛Ⅱ型链球菌(Streptococcus bovis biotypeⅡ)van B2基因真核表达质粒,并在宫颈癌HeLa细胞中进行表达。方法以牛Ⅱ型链球菌基因组为模板,采用PCR法扩增van B2基因,克隆至真核表达载体pVAX-1中,构建重组表达质粒pVAX-1-van B2。采用FuGENE HD Transfection Reagent试剂盒将重组表达质粒转染HeLa细胞,转染48 h后,RT-PCR法检测转染细胞中van B2基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Western blot法检测转染细胞中van B2蛋白的表达。结果重组表达质粒pVAX-1-van B2经双酶切及测序鉴定构建正确;重组表达质粒转染HeLa细胞48 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,RT-PCR及Western blot分析分别可见570 bp及相对分子质量20 900的目的条带。结论成功构建了牛Ⅱ型链球菌van B2基因的真核重组表达质粒,并在HeLa细胞中成功表达。本实验为进一步研究牛Ⅱ型链球菌对抗生素的耐药性机制及其与van B2基因的相关性奠定了基础。     

水牛干扰素α的可溶性原核表达、纯化及其抗病毒活性

目的在E.coli中高效表达可溶性水牛干扰素α(recombinant bovine interferon alpha,r Bo IFNα),纯化后检测其抗病毒活性。方法采用RT-PCR方法从水牛肝脏总RNA中扩增IFNα基因,插入原核表达载体p ET-32a中,构建重组表达质粒p ET-32a-IFNα,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测后,使用His Trap~(TM) HP镍离子亲和层析柱进行纯化,并采用细胞病变抑法,在水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)/MDBK细胞滴定系统上检测其抗病毒活性。结果核酸测序结果显示,r Bo IFNα基因全长498 bp,与Gen Bank报道的牛IFNαC亚型基因核苷酸序列同源性为100%;表达的r Bo IFNα蛋白主要存在于破碎菌体的上清中,表达量约占菌体总蛋白的63.8%;纯化的r Bo IFNα纯度高达98.52%,能与牛IFNα多克隆抗体特异性结合,比活性为(3.6±0.2 5)×10~6 U/mg。结论成功在E.coli中高效表达了可溶性r Bo IFNα蛋白,纯化的蛋白具有较强的抗病毒活性,为其临床应用奠定了基础。     

黄芪苷对丙型肝炎病毒的抑制作用

目的研究黄芪苷对丙型肝炎病毒(HCV)的抑制作用。方法 MTT法检测不同浓度黄芪苷对Huh7.5.1细胞的抑制作用;间接免疫荧光试验检测不同浓度的黄芪苷、利巴韦林和干扰素(IFN)的抗HCV效果;Western blot法检测不同浓度黄芪苷、利巴韦林、IFN作用的Huh7.5.1细胞中HCV NS5A蛋白的表达情况。结果不同浓度黄芪苷对Huh7.5.1细胞的抑制率不同,并呈剂量依赖性。在最佳细胞密度1×10~4个/孔、最适MOI为1的条件下进行试验,利巴韦林对细胞的毒性呈剂量依赖性;IFN无明显的细胞毒性,其抗病毒滴度为7×10~(1.77) PFU/ml;黄芪苷的细胞毒性较小,其抗病毒滴度为7×10~(3.67) PFU/ml。黄芪苷能降低NS5A蛋白的表达,且随浓度增加抑制作用越明显。结论黄芪苷具有抗HCV的能力,其作用机制是通过抑制NS5A来实现的。     

禽流感病毒NS1A蛋白诱导人肺癌细胞SPC-A1的凋亡

目的研究禽流感病毒NS1A蛋白对人肺癌细胞SPC-A1增殖的影响。方法将含有NS1A基因的重组质粒pVAX1-NS1A经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,用MTT检测其对细胞增殖的抑制作用;Annexin VFITC-PI结合流式细胞仪检测细胞凋亡率;PI结合流式细胞仪检测细胞周期的变化;对转染细胞的表达产物进行Western blot分析。结果NS1A蛋白能抑制人肺癌细胞SPC-A1增殖且呈时间依赖性。随着作用时间延长,重组质粒转染组细胞凋亡率可达38.17%,细胞周期中G0/G1比例升高,G1期阻滞。Western blot分析显示,重组质粒转染组细胞在相对分子质量约30000处可见特异性反应条带,与NS1A蛋白产物大小相符。结论禽流感病毒NS1A蛋白能够抑制SPC-A1细胞增殖,并诱导SPC-A1细胞凋亡。     

干扰素α2b基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建干扰素α2b(IFNα2b)基因真核表达质粒,并在CHO-dhfr-细胞中表达。方法从DH5α-pbv220-IFNα2b工程菌中扩增IFNα2b基因片段,克隆入psv-dhfr质粒中,构建重组真核表达质粒psv2-dhfr-IFNα2b,转染至CHO-dhfr-细胞中,经MTX加压筛选,获得稳定生长的单克隆细胞株。采用Wish细胞病变抑制法检测转染细胞中IFNα2b的抗病毒活性;提取细胞基因组DNA,进行PCR鉴定。结果重组真核表达质粒psv2-dhfr--IFNα2b经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;转染后的重组细胞表达的IFNα2b具有抗病毒活性,且活性较强;以转染细胞基因组DNA为模板,可扩增出IFNα2b基因条带。结论已成功构建IFNα2b基因真核表达质粒,并在CHO-dhfr-细胞中表达了具有生物学活性的IFNα2b蛋白,为进一步对IFNα2b进行真核表达的研究奠定了基础。     

干扰素γ对肾癌786-0细胞增殖的抑制作用及其机制

目的探讨干扰素γ(interferonγ,IFNγ)对人肾癌786-0细胞增殖的抑制作用及其可能的机制。方法用不同浓度(1 000、2 000、3 000、4 000和5 000 U/ml)的IFNγ作用人肾癌786-0细胞不同时间,CCK-8法检测细胞增殖抑制率;将786-0细胞分为试验组(加入900 U/ml IFNγ)和细胞对照组(未作任何处理),作用48 h后,流式细胞术检测786-0细胞细胞周期的分布,RT-PCR法检测细胞中肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)基因mRNA的转录水平,Western blot法检测细胞中有丝分裂抑制缺陷蛋白1(mitotic arrest deficiency 1,MAD1)的表达水平;将腺病毒质粒hepaCAM及空腺病毒质粒瞬时转染786-0细胞,Western blot检测细胞中hepaCAM及MAD1蛋白的表达水平。结果 IFNγ可抑制786-0细胞的增殖,且呈时间-剂量依赖性(P0.05);与细胞对照组相比,试验组细胞G1期细胞比例、hepaCAM基因mRNA的转录水平及MAD1蛋白的表达水平均明显升高(P均0.01);转染腺病毒质粒的786-0细胞中hepaCAM和MAD1蛋白的表达水平明显高于空腺病毒质粒组及空白对照组(P0.05)。结论 IFNγ可能通过hepaCAM-MAD1途径使细胞周期阻滞于G1期,从而抑制肾癌786-0细胞增殖,本实验为进一步研究肾癌的发生发展机制及有效治疗途径奠定了基础。     

表达HIV-1 gp160膜蛋白靶细胞的制备及鉴定

目的获得表达INV-1 gp160膜蛋白的靶细胞,用于HIV-1特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)和抗HIV-1重组毒素细胞杀伤活性检测。方法采用PCR方法,从质粒pJen 10中扩增HIV-1 gp160基因,插入pGEM-T载体,测序后克隆入pIRESl neo载体中构建成重组质粒pIRE160,酶切鉴定正确后,转染人肝癌细胞(SMMG-7721),CA18加压筛选至细胞不再死亡为止,并采用Western blot和间接免疫荧光法对制备的靶细胞进行检测。结果HIV-1 gp160在SMMC7721表面表达,并裂解为gp120和gp41蛋白。结论已成功得到稳定表达HIV-1 gp160的靶细胞,且表达的蛋白具有良好的特异性。     

利用单个B细胞制备人源SARS-CoV-2刺突蛋白单克隆抗体

目的 利用单个B细胞制备人源严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突蛋白(S蛋白)单克隆抗体，并检测其中和活性。方法 采集经2次SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)免疫，且抗体水平较高的人静脉血，用人外周血淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，经偶联S蛋白的磁珠分选表达S蛋白抗体的单个B细胞。将单个B细胞反转录后，用套式PCR法扩增IgG重链、轻链可变区基因；通过重叠PCR法将可变区基因与CMV启动子及IgG leader序列DNA片段、IgG恒定区及PolyA序列DNA片段连接，构建抗体线性表达盒。将同一B细胞的重链、轻链线性表达盒转染HEK293T细胞，表达人源SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体。免疫荧光法检测抗体免疫反应活性，假病毒中和试验检测抗体中和活性。结果 共表达了26株SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体，经Western blot检测，于相对分子质量约55 000和25 ...     

Neurturin基因的克隆及其在Vero细胞中的表达

目的克隆Neurturin(NTN)基因,并在Vero细胞中表达。方法用RT-PCR方法扩增hNTN cDNA,并克隆至pcDNA3真核表达载体中,经Lipofectamine2000转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对转染后细胞的形态及生长状况进行分析。结果重组质粒pcDNA3/hNTN转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆,且有目的蛋白表达,转染后细胞形态和生长特性发生了一定改变。结论获得了稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,为其移植并进行帕金森病猴基因治疗动物实验奠定了基础。     

癌基因c-myc对食管癌BubR1的调控

目的探讨癌基因c-myc对食管癌有丝分裂检查点效应蛋白BubR1的调控作用。方法将Bub1b基因启动子亚克隆至载体pSEAP2-Basic中,构建重组质粒pSEAP2-Bub1b-P2000,在Lipofectamine 2000的介导下,分别转染过表达c-myc的HEK-293细胞(经Ad-c-myc感染)和ECA-109细胞;转染6 h后,经c-myc抑制剂10058-F4作用ECA-109细胞。SEAP化学发光法检测各组细胞的ALP活性;采用RT-PCR和Western blot法分别检测抑制c-myc表达的ECA-109细胞中Bub1b基因mRNA转录和BubR1蛋白的表达水平。结果重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定构建正确;重组质粒转染过表达c-myc的HEK-293细胞和抑制c-myc表达ECA-109细胞的ALP活性明显升高(P<0.000 1);抑制c-myc表达可明显下调ECA-109细胞中Bub1b基因mRNA转录和BubR1蛋白的表达水平(P<0.05)。结论癌基因c-myc对食管癌细胞中BubR1的表达有正调控作用,为进一步研究BubR1在食管癌中发挥的作用奠定了基础。     

西尼罗病毒E蛋白在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的表达及其鉴定

目的利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)囊膜E蛋白,并进行鉴定。方法利用分子克隆技术将WNV E基因克隆至杆状病毒供体质粒p Fast Bac1中,构建重组供体质粒p Fast Bac-E,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组穿梭质粒Bac-E,转染sf9细胞,收获含WNV E基因的重组杆状病毒Ac MNPV-E,采用间接免疫荧光及Western blot法检测E蛋白的表达。结果重组供体质粒p Fast Bac-E经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,重组穿梭质粒Bac-E经PCR鉴定证明构建正确,转染约96 h后,sf9细胞体积变大、变圆,细胞颗粒化,进而从培养板上脱落,漂浮,收获的第1代Ac MNPV-E经PCR鉴定为阳性。感染重组杆状病毒Ac MNPV-E的sf9细胞周围出现绿色荧光,表达的目的蛋白可与兔抗WNV E蛋白多克隆抗体及鼠抗His单克隆抗体特异性结合,在相对分子质量约53 000处可见目的蛋白条带。结论利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统成功表达了WNV E蛋白,为WNV快速诊断方法及新型疫苗的建立奠定了基础。     

小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶基因的克隆表达及活性鉴定

目的克隆表达小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶(mtsAC)基因,并检测其活性,为后续研究提供技术平台。方法Trizol法提取小鼠睾丸组织总RNA,RT-PCR法扩增mtsAC基因,经测序正确后,克隆至真核表达载体pcDNA4-V5,转染HEK293T细胞,Western blot及免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达,并检测HEK293T细胞中cAMP的水平。结果所构建的重组表达质粒pcDNA4-V5-mtsAC经酶切和测序证明构建正确,插入的mtsAC基因长度为1549bp;表达的重组mtsAC蛋白相对分子质量为48000,在胞浆及胞核中呈均一性表达;转染质粒pcDNA4-V5-mtsAC的HEK293T细胞中cAMP的水平较未转染的HEK293T细胞升高约17倍,并可被NaHCO3和CaCl2激活。结论已成功克隆了mtsAC基因,并在HEK293T细胞中表达了具有活性的重组mtsAC蛋白,建立了可用于mtsAC特性研究及男性不育药物筛选的技术平台。     

稳定表达Ag85A蛋白细胞系的建立

目的建立稳定表达Ag85A蛋白的K562真核细胞系,为进一步开展以阳离子脂质体为转运载体的口服疫苗的免疫原性研究奠定基础。方法将已构建的重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A包裹阳离子脂质体LipofectamineTM 2000后,转染真核细胞K562,SDS-PAGE和Western blot分析重组Ag85A蛋白的表达。用G418筛选稳定表达Ag85A蛋白的细胞株,流式细胞术和间接免疫荧光技术检测Ag85A蛋白的表达及定位。结果重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A转染K562细胞时,与脂质体的最适比例为2μg:2μl;转染细胞表达的Ag85A蛋白相对分子质量约为32000,且具有良好的反应原性。稳定转染3个月后,重组质粒转染的细胞有42.37%的细胞显示FITC标记,且细胞胞浆中及细胞膜上均有Ag85A蛋白的表达。结论已获得稳定表达Ag85A蛋白的K562细胞系,可用于Ag85A蛋白的大量制备及抗体方面的研究。     

瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建瓣状内切核酸酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达。结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍。结论已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1。     

牛传染性鼻气管炎病毒gC结构蛋白的真核表达及其反应原性分析

目的真核表达牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gC结构蛋白,并对其反应原性进行鉴定。方法以GenBank中登录的IBRV基因序列合成gC基因全长,构建重组真核表达质粒p CDNA4-gCHis,并进行双酶切鉴定。将鉴定正确的质粒转染MDBK细胞,收集上清,镍柱纯化带有His标签的重组gC蛋白,经Dot blot和间接免疫荧光法鉴定其反应原性。结果质粒p CDNA4-gC-His经双酶切鉴定证明构建正确,表达的重组gC蛋白相对分子质量约54 000,纯化后的浓度为0. 03 mg/mL,可与IBRV免疫的兔多抗发生反应。结论成功构建了真核表达质粒pCDNA4-gC-His,并能在MDBK细胞系中正确表达,表达的蛋白与天然IBRV gC蛋白具有相同的反应原性,为后续免疫学诊断方法的建立奠定了基础。     

稳定表达绿色荧光蛋白标记的人单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体ORF2融合蛋白的Vero细胞株的建立

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框2(ORF2)融合蛋白的Vero细胞株。方法构建重组真核表达质粒pEGFP-ORF2,经酶切及测序鉴定正确后,体外转染Vero细胞,经G418筛选稳定表达融合蛋白的克隆,扩大培养后,荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR检测目的基因的转录。结果重组真核表达质粒pEGFP-ORF2经酶切及测序鉴定构建正确,经G418培养20d筛选出的Vero细胞株荧光显微镜下可见融合蛋白表达,RT-PCR检测显示,转染了重组表达质粒的Vero细胞内有目的基因的表达。结论已成功建立了稳定表达EGFP-ORF2的Vero细胞株,为进一步研究HSV-2LATORF2的功能奠定了基础。     

抑癌基因WWOX对Lewis肺癌细胞c-jun蛋白表达及其转录活性的影响

目的研究抑癌基因WWOX对Lewis肺癌细胞c-jun蛋白表达及其转录活性的影响,探讨WWOX基因的抑癌机制。方法采用脂质体转染法将WWOX基因重组真核表达质粒转染Lewis肺癌细胞,RT-PCR和Western blot法检测WWOX基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;免疫组化法检测WWOX基因转染后Lewis细胞中c-jun蛋白的表达水平;半定量RT-PCR法检测c-jun调控的4种肿瘤相关基因p21、cyclinD1、FasL及VEGF mRNA的转录水平。结果重组真核表达质粒pcDNA4.0/Myc-His-WWOX转染Lewis细胞后,WWOX基因在mRNA和蛋白水平上均得到表达;与未转染细胞和空载体转染细胞相比,WWOX基因转染细胞胞浆中c-jun蛋白的表达量升高,而细胞核中c-jun蛋白的表达量未见明显差异;p21基因mRNA的转录水平升高,cyclinD1、FasL和VEGF基因mRNA的转录水平降低。结论WWOX基因可在Lewis细胞中表达,其转染Lewis肺癌细胞后,不直接调控c-jun蛋白的表达量,但可影响其转录活性。