纳秒脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的内质网信号通路分析

ns脉冲电场在诱导肿瘤细胞凋亡方面展现出诱人的应用前景。由于ns脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚未明确,严重阻碍了ns脉冲电场肿瘤治疗的临床进程。为进一步揭示其诱导凋亡的机制,将参数组合(电压幅值9kV,脉宽100ns,脉冲30个,频率1Hz)作用于人卵巢浆液性囊腺癌(SKOV3)细胞。首先检测了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteine aspartic acid specific protease-12,Caspase-12)蛋白的释放水平,其次用浓度分别为0、25、50、100μmol/L的钙螯合剂(BAPTA-AM)螯合细胞内的游离Ca2+,用Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡率,最后采用蛋白质印迹(western blot)技术检测了Caspase-12蛋白释放的变化。试验结果表明:ns脉冲诱导SK-OV3凋亡时引起了细胞内Ca2+升高,从而介导内质网凋亡信号通路。该研究结果将进一步揭示ns脉冲诱导凋亡的机制。     

ns级陡脉冲诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

为进一步研究ns级陡脉冲诱导细胞的凋亡效应,以人卵巢腺癌SKOV3细胞为对象,进行了电场强度为10 kV/cm、脉宽为100 ns的陡脉冲实验研究。结果表明,通过流式细胞术观测发现早期凋亡率约22%;通过AO/EB荧光染色检测显示,早期凋亡细胞表现为细胞体积缩小,胞膜完整,浓聚成颗粒状,位于细胞的一侧,胞质浓缩,呈黄绿色荧光;晚期凋亡细胞体积缩小,胞膜完整,细胞核呈橙红色或红色荧光;细胞坏死时,细胞体积增大,呈不均匀的橙红色荧光,轮廓不清,已解体或接近解体。医学统计学和形态学特征表明ns级陡脉冲能诱导SKOV3肿瘤细胞发生凋亡。     

细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用

为了研究细胞骨架在ns脉冲诱导肿瘤细胞凋亡中的作用,将脉冲电场参数组合(电场强度10kV/cm,脉宽500ns,脉冲30个,频率1Hz)作用于细胞骨架裂解的Hep-G2细胞。利用Annexin-V和碘化丙碇(propidium i-odide,PI)双染法检测细胞凋亡和坏死情况;采用荧光分光光度计观测线粒体跨膜电位和细胞膜穿孔的变化情况。试验发现:肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞凋亡和坏死大大降低(与单独脉冲处理组相比检验水平P<0.05),早期细胞凋亡由(16.94±2.87)%下降到(4.77±1.87)%;晚期凋亡和坏死由(20.94±3.09)%下降到(14.38±2.60)%;脉冲处理组和肌动蛋白裂解后脉冲处理组的细胞线粒体跨膜电位都出现下降,但后者的线粒体跨膜电位却明显高于前者(P<0.05);单独脉冲处理组和细胞骨架缺失后脉冲处理组二者在相同时间点时其PI荧光强度无明显差异,且PI荧光随时间而变化的规律亦相似。上述结果表明:细胞骨架的缺失抑制了ns脉冲诱导细胞凋亡的线粒体通路,进而降低细胞凋亡水平,但对细胞膜的穿孔情况无明显影响。     

裸鼠皮下人恶性黑色素瘤在纳秒脉冲电场下的凋亡机制

为研究ns脉冲电场(nsPEF)治疗在体肿瘤的生物电效应机制,以接种人黑色素瘤细胞A375的BALB/c裸鼠为研究对象,采用电压幅值为4kV、脉冲宽度为200ns、重复频率为1Hz的脉冲电场进行处理。用凝胶电泳法检测脉冲处理后的DNA Ladder分布情况表明,与对照组相比,处理组有明显阶梯状分布,即细胞发生凋亡。用TUNEL法检测肿瘤组织的凋亡情况表明,处理组表现出较高凋亡率(检验水准P<0.01)。用Western blot法和免疫组织化学方法检测脉冲处理后肿瘤组织中促凋亡蛋白Bax、凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量情况,2者共同表明,与对照组相比,处理组Bax表达量显著升高(P<0.01),而Bcl-2表达量明显降低(P<0.01)。实验结果揭示nsPEF通过Bax、Bcl-2基因调控作用来诱导肿瘤凋亡。     

微秒脉冲电场场强参数的窗口效应

μs脉冲电场诱导细胞产生的可逆电穿孔效应和不可逆电穿孔效应已有一定研究,但其所诱导的细胞凋亡效应却往往被忽略,诱导凋亡效应的脉冲电场与产生可逆/不可逆电穿孔效应脉冲电场的剂量关系更是鲜有研究.为了解这些关系,以人宫颈痛细胞系Hela为实验对象,综合运用PI示踪穿孔、CCK-8法检测活性及流式细胞术测定凋亡3种实验手段,...     

ns脉冲电场诱导裸小鼠皮下人黑色素移植瘤凋亡

为研究ns脉冲电场对在体肿瘤的诱导凋亡效应,以接种人黑色素瘤细胞A375的BALB/c裸小鼠为对象,采用电场强度20kV/cm、脉冲宽度300ns的脉冲电场处理后,抑瘤效应宏观观察到肿瘤组织的生长受到显著抑制(P<0.01),透射电子显微镜观察到典型的凋亡细胞超微结构形态,免疫荧光染色法定性检测到caspase-3蛋白表达明显增强,用RT-PCR方法定量检测到caspase-3 mRNA表达明显增强(P<0.01)。实验结果证实了ns脉冲电场能有效抑制在体肿瘤组织生长,机制在于其通过活化肿瘤细胞caspase-3蛋白酶而诱导肿瘤细胞调亡,为ns脉冲电场治疗肿瘤提供了依据。     

纳秒脉冲电场治疗引起的肿瘤微环境变化有助于肿瘤消融

为了观察研究ns脉冲电场(ns PEFs)导致肿瘤微环境变化对肿瘤消融效果的影响,设计进行了细胞实验和动物实验。细胞实验是利用ns脉冲电场电击人肝癌细胞HCCLM3细胞,通过流式细胞仪和CCK-8法分别检测电击后肿瘤细胞的凋亡坏死和增殖抑制情况。动物实验是通过苏木精-伊红(HE)染色法观察实验组肿瘤内的炎性细胞浸润情况和肝脏血管管腔电击后的凝血栓塞情况。实验结果表明:当脉冲数n较小(n=6、12)时,细胞凋亡坏死较少;当脉冲数n加大(n=18、30)时,细胞凋亡坏死明显增加且24 h时间后的增殖率明显降低;电击处理大鼠肝脏后发现电场作用范围内的血管出现广泛凝血栓塞;实验组裸鼠肿瘤体积逐渐缩小成疤痕状,肿瘤内出现大片坏死伴弥漫炎性细胞浸润。可得结论:ns脉冲电场对皮下肿瘤消融过程中主要引起3个方面的微环境变化从而有助于对局部肿瘤的控制,包括电场本身引起的部分肿瘤细胞即时坏死凋亡、肿瘤供血血管栓塞导致的继发性肿瘤缺血坏死、富集的炎性细胞引起的肿瘤自我消亡。     

高频纳秒脉冲串对皮肤癌细胞的杀伤效果实验研究

为了克服目前脉冲电场治疗肿瘤所存在的不足,研究了高频ns脉冲串对人体黑色素瘤细胞A375即皮肤癌细胞的杀伤效应,通过改变电场强度、脉冲宽度、脉冲串内重复频率、脉冲串内脉冲个数等参数,分析了不同参数的高频ns脉冲串作用时细胞凋亡率和细胞坏死率的规律。研究结果表明：细胞坏死率随着脉冲串内重复频率的升高而增加,细胞凋亡率则是随着脉冲串内重复频率的升高而降低,因而在借鉴调制技术时,脉冲串内重复频率不宜太高;脉冲串内高电平持续时间相同时,脉冲宽度较大的脉冲所引起的细胞凋亡率和细胞坏死率比脉冲宽度较小的脉冲高,并且其细胞凋亡率之差随着电场强度的增加而减小,细胞坏死率之差随着电场强度的增加而呈现先增大后减小的趋势,因此在电场强度较高时,为了更好地平衡ns效应和μs效应,可以适当降低脉冲宽度并同时增加脉冲串内脉冲个数;另外,细胞悬液阻抗比可以作为反映细胞坏死率的参数,细胞坏死率与细胞悬液阻抗比降低率成正比。这些研究结果为后续高频ns脉冲串的类似应用提供了参考。     

纳秒脉冲电场治疗裸鼠皮下人恶性黑色素瘤模型的长期效应

为研究ns脉冲电场(nsPEF)对在体肿瘤的长期杀伤效应,以接种人恶性黑色素瘤A375细胞的BALB/c裸鼠为研究对象,采用电压幅值为4kV、脉冲宽度为200ns、重复频率为1Hz的ns脉冲电场进行治疗。肉眼观察结果表明,瘤体随时间推移而逐渐消褪直至消失,且皮肤恢复完好,原位瘤在平均2周时间内完全消失;瘤体生长抑制情况检测结果表明,与对照组相比,治疗组裸鼠肿瘤体积明显缩小(检验水准P<0.05),随着生存时间延长,对照组和治疗组肿瘤生长速度差别增大;荷瘤裸鼠的存活率-时间关系研究结果表明,ns脉冲电场治疗后26d时间内,对照组裸鼠全部死亡,而治疗组裸鼠存活率高达100%。实验结果表明ns脉冲电场能有效抑制肿瘤组织的生长,并可大大提高荷瘤BALB/c裸鼠的长期存活率。     

细胞膜电穿孔及其肿瘤治疗的研究

电穿孔是在脉冲电场作用下细胞膜暂时出现微孔的物理过程 ,其结果是细胞内外分子交换显著增加 ,有利于细胞吸收各种药物、基因物质、蛋白质和其它大分子等。电场取消后微孔关闭而不会对细胞造成任何影响。电穿孔对于研究脉冲电场作用下细胞的结构和功能有重大意义 ,这种瞬时可逆的膜渗透性增强大大促进了化疗药物的跨膜运送 ,有效地提高了其杀伤力 ,为肿瘤的综合治疗提供了一种新思路     

纳秒脉冲处理A375细胞裸鼠皮下移植瘤的疗效评估

ns脉冲电场可以诱发肿瘤细胞的结构和功能发生一系列变化,使其在临床肿瘤治疗中展现出巨大的应用前景。目前,受限于检测评估手段,相关动物实验研究尚不充分。将ns脉冲(电场强度20kV/cm、脉宽200ns、重复频率5Hz、2 000个脉冲)作用于A375裸鼠皮下移植瘤,采用荧光活体成像方法定量研究ns脉冲的抑瘤效果,同时用相机随访观察局部疤痕的转归情况。与对照组荧光增加相比,处理组荧光强度逐渐减弱(检验水准P<0.05),且在第2次处理后14d荧光完全消失;随着时间的推移,治疗区域局部疤痕逐渐变浅,并在第2次处理后22d完全消失。实验结果表明,ns脉冲可以实现局部肿瘤组织的完全切除,且能实现皮肤疤痕的有效转归。     

ns脉冲电场诱导细胞脂双层膜电穿孔的仿真分析

为探讨ns脉冲电场诱导细胞器膜产生电穿孔的机理,采用分子动力学软件从原子水平上分析了ns脉冲电场作用下细胞脂双层膜电穿孔形成及其孔径随时间变化的过程,研究了电穿孔形成的机理。结果表明,脂质分子的偶极子在脉冲电场作用下的振动和转动导致脂双层膜出现初始缺损并诱导脂双层膜电穿孔;电穿孔初期的多微孔间存在耦合关系;在4～5 ns内电穿孔形成并达到动态稳定。结果与细胞脂双层膜的粗粒化模型计算吻合较好,为电穿孔技术在生物医学等方面的应用提供了理论指导。     

Elastic Scattering Spectroscopy as a Diagnostic Tool for Apoptosis in Cell Cultures

Apoptosis, ldquoprogrammed cell death,rdquo is a cellular process exhibiting distinct biochemical and morphological changes. There is much interest regarding the role of apoptosis in cancer and the response to cancer treatment. Although apoptosis can occur spontaneously in malignant tumors and often significantly retards their growth, the initial response to successful cancer treatment is often massive apoptosis. In typical in vitro studies, current apoptosis detection methods require cell culture disruption via fixation, trypsinization, and/or staining. Our aim is to develop a nondisruptive optical method of detecting and tracking apoptosis in living cells and tissues, initially focusing on cell cultures. Such a method would allow for real-time evaluation of apoptotic progression of the same cell culture over time without perturbation or alteration. We report initial studies on the use of in vitro elastic scattering spectroscopy (ESS) to monitor changes in light-scattering properties of cells due to apoptotic morphology changes. For a sequence of times post treatment, we have measured the angle-dependent scattering at a single wavelength and also the wavelength-dependent scattering at discrete angles, of treated and control cell cultures. A novel polar nephelometer, developed in our laboratory, was used to obtain the angle-dependent scattering for the range of 90-145. Wavelength-dependent ESS measurements were made with a spectrometer, for several discrete near-forward angles. The results indicate that light scattering measurements can reliably discriminate between treated and control cells, correlating well with benchmark assays for apoptosis.