应用“克隆法”筛选流行性腮腺炎疫苗毒种

２０００年版《中国生物制品规程》（以下简称《规程》）要求腮腺炎疫苗的半成品滴度不低于４．７５ＬｏｇＣＩＤ５０／１．０ｍｌ,成品３７℃放置７ｄ前后滴度均不低于４．０ＬｏｇＣＣＩＤ５０／１．０ｍｌ。我们通过克隆法筛选主代种子批疫苗毒种,选育出毒力强且稳定性好的工作种子批腮腺炎疫苗毒种。 以常规方法用０．１２５％胰酶消化３个９日龄ＳＰＦ鸡胚,制备鸡胚细胞（ＣＥＣ）悬液６０ｍｌ,每毫升悬液含４×１０６个ＣＥＣ,分别按７×１０５个ＣＦＣ／孔和１０６个ＣＥＣ／孔各接种３个２４孔组织培养板,补加生长液至２．０…     

甲型肝炎病毒(H2株)快速适应变异株全基因序列分析

目的 探索甲型肝炎病毒（Ｈ２株）细胞适应的分于机制。方法 将甲型肝炎减毒活疫苗毒株（ＨＡＶ Ｈ２Ｋ７）在人胚肺二倍体细胞ＫＭＢ１７上快速连续传代增强适应（１４ｄ）,检测连续传代后抗原滴度和感染性滴度,测定 第１８代（ＨＡＶ Ｈ２Ｋ７Ｐ１８）全基因组序列。结果 适应至第１８代抗原滴度达１：５１２,感染性滴度为７．５ＬｏｇＣＣＩＤ５０／ｍｌ。 整个基因组出现了１０个核苷酸突变,变异卒为０．１３％,变异较大区域位于５’末端非编码区（５’ＵＴＰ）,有３个核苷酸 变异。编码区７个交变,２个是无义突变,５个有义突变导致５个氨基酸变化,分别位于 ＶＰ２ Ａ－Ｓ;２Ｃ,Ｑ－Ｐ;３Ａ,Ｒ－ Ｃ;３Ｃ,Ｔ－Ａ和３Ｄ,Ｖ－Ｇ。结论 ＨＡＶ Ｈ２Ｋ７４因组５’ＵＴＲ、２Ｃ区、３Ａ区、３Ｃ区和３Ｄ区变异协同作用促进在 ＫＭＢ１７ 细胞上快速增强适应。     

甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的适应性

目的研究甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞Walvax-2(W2)上的传代适应性,并确定其在W2细胞上培养的最适条件。方法将甲肝病毒YN5株P23代采用混合吸附的方式接种于T225细胞培养瓶,连续传至30代,检测各代次YN5D株病毒的抗原滴度及感染性滴度;将甲肝病毒YN5D株P29代以不同的MOI接种W2细胞,以最佳MOI接种细胞,确定最佳收毒时间;建立甲肝病毒YN5D株三级种子库,并进行检定。结果甲肝病毒YN5株连续传至30代,抗原滴度及感染性滴度均保持在10 240 EU/mL和7.00 lgCCID_(50)/mL以上;当接毒比例为0.5 MOI时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高;当培养至24~28 d时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高,分别为2 560 EU/mL和7.24 lgCCID_(50)/mL。三级毒种库各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论确定了甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的传代适应性,并优化了细胞工厂的培养条件,为人二倍体甲肝疫苗临床申报样品的制备工艺奠定了基础。     

两种甲型肝炎病毒培养法和病毒滴定法的比较

目的　比较不同细胞培养方法和不同滴定方法的甲型肝炎病毒的滴度。方法　采用小方瓶细胞培养法和 2 4孔板培养法培养单层细胞 ,待细胞病毒培养至高峰期 ,用胰酶消化收集细胞病毒 ,再用细胞裂解液裂解细胞释放病毒 ,用ELISA法和间接免疫荧光法检测病毒滴度。结果　用两种检测方法检测同一样品 ,结果差异无显著意义。用两种细胞培养方法 ,用相同检测方法 ,结果差异亦无显著意义。结论　两种细胞培养方法及两种检测方法检测的病毒滴度差异无显著意义 ,但应用ELISA法 ,操作简便 ,结果准确     

规范化H_2株甲肝减毒活疫苗的免疫原性

“八五”期间，对国产Ｈ２株甲肝减毒活疫苗进行了大规模现场考核，由于现场所用疫苗滴度偏低（约为１０５.０～５.５ＴＣＩＤ５０），免疫后抗体阳性率仅为３０％－４０％，保护效果约为７０％，结果不甚理想。为此我们对滴度在 １０６.５ＴＣＩＤ５０以上的疫苗（规范化）再度进行了大规模现场考核。结果如下： １９９６年 １０～ １１月份对正定县 Ａ、Ｂ、Ｃ三个乡 ２４个行政村１～７岁儿童，通过询问调查，采血检测，凡无肝病史、甲肝疫苗注射史，半年内没有使用过免疫球蛋白，且血清抗－ＨＡＶ阴性者为观察对象。按出生单、双月分为…     

冻干甲乙型肝炎联合疫苗组分相容性的研究

目的研究冻干甲乙型肝炎联合疫苗组分的相容性。方法将所制备的联合疫苗与同批单价甲型肝炎减毒活疫苗及重组乙型肝炎疫苗进行甲肝病毒滴度和乙肝疫苗效力检测,同时分别以联合疫苗与甲型肝炎减毒活疫苗及重组乙型肝炎疫苗接种恒河猴,检测甲肝抗体和HBsAb阳转率。结果该联合疫苗与同批单价疫苗的甲肝病毒滴度和乙肝疫苗效力及诱导猴体的甲肝抗体和HBsAb阳转率差异均无显著意义。结论冻干甲乙型肝炎联合疫苗组分间无拮抗作用,具有相容性。     

甲型肝炎灭活疫苗接种普通狨猴的安全性和免疫原性

目的观察本实验室研制的甲型肝炎灭活疫苗的安全性和免疫原性。方法甲型肝炎病毒吕－８ 株在人胚肺二倍体细胞（ＫＭＢ１７）中增殖,收获的病毒液用福尔马林灭活制成实验性疫苗,接种普通狨猴。结果有 特异性抗ＨＡＶ产生,无血清酶活性升高和肝组织病理学改变。接种疫苗的狨猴均能抵抗甲肝病毒强毒株的攻击, 而对照组均出现酶活性升高和肝组织病理学改变。结论该疫苗具有良好的免疫原性和可靠的安全性。     

丙烯酸酯胶粘剂聚合物剥离后形态结构的研究

本文考察了从Ｐｙｒｅｘ玻璃上剥离后的各种丙烯酸酯胶粘剂聚合物的形态结构．丙烯酸酯聚合物（丙烯酸－２－乙基已酯（２ＥＨＡ）－丙烯酸（ＡＡ）－醋酸乙烯酯（ＶＡｃ）共聚物）Ｐ（２ＥＨＡ－ＡＡ－ＶＡｃ）的组成比为：２ＥＨＡ／ＡＡ／ＶＡｃ＝１００／０／０（ＥＥＨＡ００００），９５／５／０（ＰＥＨＡ０５００），９２／８／０（ＦＥＨＡ０８００）和８５／５／１０（ＰＥＨＡ０５１０）（ｍｏｌ％）．ＰＥＨＡ００００的剥离类型为伸长的锯齿状；而ＰＥＨＡ０５００和ＰＥＨＡ０８００剥离后在锯齿的边缘呈特征的分支带ＰＥＨＡ０５１０剥离形态呈有规则的锯齿状．用动态热力学分析方法，表面张力试验法和荧光探测技术探测了不同类型丙烯酸胶粘剂聚合物的剥离形态．关键词     

冻干乙型脑炎活疫苗在不同温度下保存对免疫力的影响

目的 了解冻干乙脑活疫苗在不同温度下保存对滴度及免疫力的影响。方法 冻干乙脑活疫苗 在不同温度下存放不同时间后,进行病毒滴度及免疫力检测。结果 疫苗在４－８％下存放１年半滴度稍有下降 （０．３２ＬｏｇＰＦＵ）,其免疫力仍稳定在高水平（ＩＤ５０＝４．１×１０－５;在 ２５℃下存放 １个月和 ３７℃下存放７ｄ,滴度分别下降 ０．３２和 ０．６５ＬｏｇＰＦＵ,其免疫力仍保持在较高范围内（ＩＤ＝８．８ ×１０－5和 ６．０×１０－５）;在５０℃下存放２４ｈ滴度和免疫 力均显著下降（近１０倍）;存放７２ｈ后基本无免疫力。结论 疫苗不论在４－８、２５、３７℃下存放,其滴度保持在４． ８７ＬｏｇＰＦＵ以上时,仍有免疫力;疫苗滴度不低于５．７ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ时,仍保持高免疫力。     

腮腺炎活疫苗毒力滴定方法的改进

<正> 将冻干腮腺炎活疫苗用病毒稀释液溶解后,按10~(-1)～10~(-5)连续稀释,每稀释度接种在微量组织培养板上0.1 ml/孔(过去用组织培养方瓶),同时设参考品和细胞对照。病毒滴定各孔补加Vero细胞0.1 ml(约20000);细胞对照补加病毒稀释液0.1 ml,放35℃含5％CO_2孵箱内4天观察细胞病变(CPE),8天判定结果。看完CPE倒掉上清,加0.5％鸡红细胞悬液,放室温(20℃左右)30分钟,倒掉上清.用0.02 mol/L PBS洗2～3次,在镜下观察血吸附反应(HAD)并记录。 3批单价疫苗和3批二联疫苗在一块组织培养板上用两法滴定的结果见附表。     

甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)不同间隔时间加强免疫的效果

为进一步探讨甲型肝炎减毒活疫苗的优化免疫方案，我们进行了不同间隔时间加强免疫的效果观察，现将结果报告如下。 甲型肝炎减毒活疫茵（Ｈ２株）为浙江普康生物技术股份有限公司生产。滴糜为１０６．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ，每剂１ｍｌ，皮下注射。 观纂对象为浙江省台州市椒江区，随机挑选４个小学的学生，年龄在７－１３岁之间，以前从未接种过甲肝央苗，且抗－ＨＩＶ－ＩｇＧ队为阴性（ＥＬＩＳＡ法）。总人数２５９名，分别于第１针接种后６个月，１２个月，３年和６年接种第２针，观察抗－ＨＡＶ－ＩｇＧ阳转率及几何平均滴度（ＧＭＴ…     

甲型肝炎病毒在细胞培养时的最佳收获期

为获得较高滴度的甲型肝炎病毒抗原（以下简称HAAg），除有优良的毒种外，选择最佳收获期是关键。本文观察了HAV在细胞内的增殖动态，以确定病毒滴度达到高峰的最佳收获期。这对制备甲肝疫苗及甲肝诊断制剂均有实用价值。实验用已适应KMB17人胚肺二倍体细胞的甲肝病毒H。减毒株。以相当于106.0TCID50病毒接种干KMB17单层细胞后，置35℃培养，于培养后第7天、14天、18天、22天、26天、28天和31天，各取2瓶细胞，奔去维持液，以0.25%胰酶消化后用PBS液收取细胞，经提取后合并提取液。同时取未感染病毒的正常细胞按同法处理作为对照。…     

核—壳型丙烯酸乳液压敏胶聚合工艺的研究

以ＶＡＥ乳液为核,以ＢＡ－ＶＡｃ－ＨＥＭＡ等混合单体为壳,采用核－壳乳液聚合工艺研制出一种新型丙烯酸乳液压敏胶,讨论了核,壳,乳化剂,引发剂,聚合温度等因素对压敏胶性能的影响,ＶＡＥ用量１２．５％,ＢＡ：ＶＡｃ：ＨＥＭＡ：ＡＡ＝８．７：１．２：０．３：０．１,使用过硫酸铵加ＮＨ４Ｓ２Ｏ８－ＮａＨＳＯ３氧化还原体系为引发剂,制得的压敏胶性能优良。     

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。     

α_1-抗胰蛋白酶制剂的制备及其病毒灭活

目的 从Ｃｏｈｎ　ＦⅣ中提纯α１－抗胰蛋白酶（α１－Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ　α１－ＡＴ，制备较高纯度α１－ＡＴ制剂。方法 对Ｃｏｈｎ ＦⅣ抽提液经沉淀、超滤、离子交换及凝胶过滤，提纯 α１－ＡＴ用巴氏法（液态，６０℃，１０ｈ加热）作病毒灭活， 并考察其效果。用免疫单扩散、双向交叉免疫电泳、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及合成基质法检测α１－ＡＴ蛋白及生物活性。用区带 扫描法测定α１－ＡＴ制剂的纯度。结果３批试制的α１－ＡＴ制剂的纯度为９１．３±１．５２％，比活０．４９±０．０８μ／ｍｇ，比活性 比抽提液提高了２７．４倍。巴氏法处理可使ＶＳＶ、Ｓｉｎｄｂｉｓ、Ｐｏｌｉｏ　Ｉ型疫苗病毒分别降低１０．０±０．３，１０．０±０．３１及７．１１ ±０．３ｌｇＴＣＩＤ５０／ｍｌ，但仍能检出Ｐｏｌｉｏ型疫苗病毒。结论 可从 Ｃｏｈｎ ＦⅣ中制得较高纯度的 α１－ＡＴ制剂，巴氏法能对 α１－ＡＴ制剂作有效的病毒灭活处理。     

肠道病毒71型在Vero细胞中培养条件的优化

目的优化肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)在Vero细胞中的培养条件。方法分别采用吸附法和直接接种法将EV71接种于Vero细胞中进行增殖,检测病毒滴度;选择最佳接种方法接种病毒,考察血清浓度、收毒方式、病毒接种量(MOI)和收毒时间对病毒滴度的影响。结果将MOI为0.02～0.2的病毒直接接种于不含血清的培养基中,培养60 h,胞外收毒,可获得较高的病毒滴度。结论优化了EV71在Vero细胞中的培养条件,为EV71的大规模培养及其疫苗研发奠定了基础。     

不同酶标试剂盒及不同方法检测甲肝总抗体比较

为提高本所甲肝总抗体酶标试剂盒的灵敏度,将原常规法10μｌ血清加样量增大至20μｌ,ＨＡＶ抗体酶标记物量相应调整作为改良法,并比较两法的灵敏度及符合率。选127份血清用Ａｂｂｏｔｔ第2代试剂盒竞争法,即加40μｌ血清和170μｌ酶结合物,检测其抗ＨＡＶ总抗体,抗ＨＡＶ阳性68份,阴性59份;用我所试剂盒常规法检测55份阳性,72份阴性;用改良法检测66份阳性,61份阴性。两种方法检测结果与Ａｂｂｏｔｔ试剂盒的检测结果比较,改良法和常规法的灵敏度分别为971%和809%,总符合率为977%和897%。改良法比常规法的假阳性率高17%,但假阴性率低132%,改…     

百日咳疫苗血清学效力试验与小鼠保护力试验结果的相关性

目的 了解百日咳疫苗血清学效力试验（ＰＳＰＴ）与小鼠保护力试验（ＭＰＴ）结果的相关性,为该法替代ＭＰＴ积累资料。方法 用不同剂量的ＤＴＰ疫苗免疫小鼠,４ｗ后采血,用ＥＬＩＳＡ测定小鼠血清中抗百日咳菌表面 抗原的总抗体滴度。用平行线法计算疫苗的效力,与ＭＰＴ测定结果进行相关性分析。结果１５批疫苗分别用 ＰＳＰＴ和ＭＰＴ法测定的效力单位相关性显著（ｒ＝ ０．９３５８,ｐ＜０．００１）,二者差异无显著意义（Ｐ＞０．０５）。与 ＭＰＴ法相 比,ＰＳＦＦ法有更高的重复性,而且９５％可信限较小。结论ＰＳＰＴ法有望取代ＭＰＴ。     

细胞荧光转化灶法检测狂犬病病毒滴度

目的应用细胞荧光转化灶(fluorescence focus units assay,FFU)法检测狂犬病病毒滴度。方法将狂犬病病毒稀释后接种BSR细胞,培养22~24 h,用FITC标记的抗狂犬病病毒特异性抗体进行染色,计数病毒感染细胞的荧光灶数,计算病毒滴度。采用乳鼠半数致死量(median lethal dose,LD50)法和建立的方法分别测定14批狂犬病病毒滴度,分析两者间的相关性;取同一份病毒液,于不同时间点检测3次,每个时间点重复检测6次,验证方法的重复性;取3份滴度不同的病毒液,由2个操作者在不同时间重复测定3次,验证方法的中间精密性;将同一份病毒液按2倍梯度稀释,共9个稀释度,分别检测病毒滴度,重复测定3次,确定该方法的线性范围。应用建立的方法检测38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度。结果乳鼠LD50法测定14批狂犬病病毒的-Lg LD50值范围为4.20~8.19,FFU法Lg FFU值范围为3.76~7.69,两种方法检测结果趋势相同,线性回归相关系数R-Sq(调整)=96.1%,存在良好的正相关性;同一个时间点检测6次及不同时间点检测3次的CV值均小于2.00%;两个操作者在不同时间重复测定3次的CV值均小于8.00%,两个操作者之间的检测结果差异无统计学意义(P>0.05);样品浓度与Lg FFU呈良好的线性关系,R-Sq(调整)=99.3%,线性范围为2.26~6.12。38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度平均Lg FFU在3.63~7.69之间,SD值在0.021~0.57之间,CV值小于10.00%。结论建立的细胞FFU法准确性、重复性、中间精密度好,该方法可用于检测狂犬病病毒滴度。     

戊肝病毒(HEV)IgG抗体酶联免疫试剂盒的质量分析

由于戊型肝炎病毒研究的快速发展,近年来已有数家试剂厂研制生产出ＨＥＶＩｇＧ抗体酶联免疫试剂（ＥＬＩＳＡ）,极大地促进了该病毒的研究工作。作为一种新型试剂,它的质量如何,除用国家参比品检定外,还应进一步进行临床考核,为此我们挑选了３家该试剂（其中Ａ为进口,Ｂ、Ｃ为国产试剂）,分别对不同人群进行检测,分析比较其灵敏度的特异性。 １．经Ａ、Ｂ、Ｃ ３家试剂分别检测,健康人群中（１６２人）ＨＥＶ　ＩｇＧ抗体的阳性率分别为：２２．８％、４．９％、８．０％ ;散发肝炎病人中（２６９人）ＨＥＶ ＩｇＧ抗体的阳性率…