纤维素酶EGA基因在枯草芽孢杆菌中的表达及其产物性质研究

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是一种高效的外源蛋白表达菌株,能将目的蛋白分泌到细胞外的培养基中.从福寿螺胃液共生菌株Bacillus sp.Strain AC-1基因组中克隆纤维素酶EGA的基因序列,利用基因工程技术构建纤维素酶EGA的重组枯草芽孢杆菌表达载体pAUsp-ega.该载体含有一个强启动子和一段信号肽,经淀粉诱导能表达外源蛋白.以枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失型菌株WB700为宿主菌,表达得到的重组纤维素酶EGA以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物得到的培养基上清酶活力达到1 120 U/L.该纤维素酶在pH 6.0表现最大水解活力,最适反应温度为60℃,在酸性条件下稳定性良好,具有较好的应用前景.     

青霉素酰化酶（PGA）在枯草芽孢杆菌基因组上的整合表达

将巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶(PGA)基因整合进枯草芽孢杆菌的基因组,筛选获得可以使PGA稳定表达的枯草芽孢杆菌菌株,克服了枯草芽孢杆菌中质粒表达不稳定的缺点.分别构建了含不同PGA基因拷贝数的3种枯草芽孢杆菌菌株,同时分析了这些菌株中PGA表达量的差异.37℃试管培养36 h菌株B.subtilis/xhoI-,aprE-,vpr--的酶活力为3U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga为6 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga,aprE::pga为14 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga,aprE::pga,vpr::pga为23 U/L.结果表明,整合的拷贝数越多,PGA的表达量越高.     

分子伴侣CsaA过表达及wprA蛋白酶的缺失对枯草芽孢杆菌分泌表达外源蛋白的影响

在枯草芽孢杆菌B.subtilis168菌株,以及在其改造菌株B.subtilis168wprA和B.subtilis168/wprA::csaA中表达来自碱性芽孢杆菌C-125的碱性果胶酶和来自巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶.碱性果胶酶在B.subtilis中分泌表达时,敲除了wprA蛋白酶基因的B.subtilis168wprA菌株相对于其野生型菌株B.subtilis168分泌表达的总的酶活力下降了36%,再次整合csaA进wprA位点后的B.subtilis168/wprA::csaA菌株,其表达量又恢复到相当于野生型菌株的表达水平.青霉素酰化酶在B.subtilis168wprA-菌株中的表达与野生型相比没有明显差异;而整合csaA分子伴侣进wprA位点后的菌株(B.subtilis168/wprA::csaA),相对于野生型其总的酶活力高出66%,说明分子伴侣CsaA数量的增加可以明显提高酶的表达量,并显示出普遍提高蛋白总活力的作用,而蛋白酶wprA基因的敲除,对某些蛋白的表达量能够产生明显的影响,在提高表达的稳定性方面表现出普遍的促进作用.本实验表达的青霉素酰化酶酶活力(14.7 U/mL)比工业应用中的酶活力(10 U/mL)高出了47%.     

高表达PGA的枯草芽孢杆菌蛋白质组学研究

为了解外源蛋白高表达时枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统胞内蛋白质组的变化,实验建立了青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase,PGA)高表达B.subtilis系统,可达到1.6 g/L的表达量以及10 U/mL的酶活;通过双向电泳技术(2-DE)分离PGA高表达以及低表达重组菌中胞内蛋白,软件分析结果显示,两者胞内蛋白表达差异极大;通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定出其中6个差异蛋白,其中4个与PGA高表达抑制菌体生长相关,而PhoR和YxiE则与PGA高表达分泌胁迫机制有关.     

一株碱性果胶酶高产菌株的筛选与鉴定

对天津盐碱地土壤样品中分离筛选的碱性果胶酶高产菌株进行生理生化及分子生物学鉴定,确定其生物学分类地位。以果胶为底物从土壤中筛选碱性果胶酶生产菌株,对复筛获得的菌株L520进行16SrDNA基因测序和分析,结合Biolog微生物鉴定系统完成L520的菌种鉴定;常规的生理生化反应鉴定进一步阐明该菌株的生理生化特性。菌株L520在LB培养基上培养10 h左右产中生芽孢,能利用葡萄糖、甘露醇、木糖为碳源进行生长,降解淀粉,水解酪蛋白但不水解酪氨酸;16SrDNA（NCBI登陆号FJ906822）结果显示该菌株与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等有99%的相似性,Biolog鉴定系统中菌株L520培养16~24 h与Bacillus subtilis A相关数据为PROB 99%,SIM 0.853,DIST 2.06。该碱性果胶酶高产菌株分类学上属于芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis L520,碱性果胶酶发酵活性达到45 U/mL。     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus的耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB被克隆到大肠杆菌—枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中，然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合栽体pSAS144中，转化Bacillus subtilis受体菌BD170，在5μg／mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子，经摇瓶发酵后，得到耐热乳糖酶的比酶活为0．32U／mg，是出发菌株比酶活的2倍。     

生物复合型破乳剂破乳特性研究

为解决现有生物破乳剂破乳效率低、稳定性差、易受环境影响、难以大规模生产的问题,将具有破乳效果的莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）在改进的无机盐液体培养基中混合培养,得到了一种高效生物复合型破乳剂.生物复合型破乳剂全培养液在室温下,接触时间48h可...     

响应面法优化HPEF杀菌工艺研究

为了弄清高压脉冲电场(HPEF)的杀菌作用,研究高压脉冲电场对培养液中枯草芽孢菌(Bacillus subtilis,简称B.subtilis)的杀灭效果.以枯草芽孢杆菌为模式菌株,采用高压脉冲电场处理,在单因素实验基础上,响应曲面法考察了高压脉冲电场强度、脉冲频率和杀菌时间对杀菌的效果的影响.通过回归方程求解和响应曲面分析,得到了二次多项式提取回归模型,并通过模型求得高压脉冲电场的杀菌试验的最优解.通过验证,实验值与模型预测值拟合性良好,能较好地反应高压脉冲电场对液体物料中枯草芽孢杆菌的致死效果.得到杀菌最优工艺条件为:电场强度为25.4 kV/cm,脉冲频率为797.0 Hz,脉冲处理时间为120.0 s,致死率为95.24％.     

固定化地衣芽孢杆菌胞外脂肪酶的制备

脂肪酶是一类重要的水解酶,广泛应用于食品、医药、化工等领域。脂肪酶通过固定化可以提高酶的使用效率。文章采用戊二醛共价连接法将来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的胞外脂肪酶固定于氨基型载体ZH-HA之上,将1g载体置入10mL酶液中反应3h后固定化酶活力达到最高为60U/g湿载体。经固定化后该酶的温度稳定性得到显著提升,当反应温度为45℃时最高酶活力达到220U/g湿载体。同时,固定化使酶在碱性条件下的稳定性得到提高,最适反应pH值为10。通过自制柱式反应器考察该酶工作稳定性,经过15批连续水解反应,固定化脂肪酶仍保持90%的活力,展现出良好的稳定性。     

纳豆枯草杆菌的分离鉴定及发酵条件优化

从日本食品纳豆样品中,分离得到11株具有纤溶酶活性的产酶菌株,对其中酶活力最高一菌株N 06进行菌落形态、菌体形态及生理生化特性鉴定,鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌。并对该菌株进行液体发酵研究,优化了N 06菌株的最佳液体发酵培养基的碳源、氮源以及碳氮比的组成,即葡萄糖1.5%,蛋白胨1.5%,碳氮比1∶1。     

产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选

为了得到产胶原蛋白酶的微生物,以海产品市场附近采集的污泥为样品,经过富集培养后通过明胶培养基进行筛选,获得1株产胶原蛋白酶的菌株。通过形态观察和生理生化特征分析,以透明圈和菌落直径之比(HC)为检测指标,初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属。对它产生的胶原蛋白酶进行分离和活力测定,得到的酶活力为44.982 U/mL。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,该酶将分子质量为100 ku左右的胶原蛋白水解成为8 ku左右的短肽,说明该酶能有效水解胶原蛋白。     

枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶的异源表达

以野生型枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增获得带有sD序列及谷氨酸棒状杆菌信号肽AS0949的BTG基因。将其与大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体pXMJ19连接,构建重组质粒pXMJ19-Sbtf转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。经IPTG诱导后该重组茵发酵液具有交联酪蛋白的能力,表明该重组茵能够实现分泌表达。     

蜡样芽孢杆菌对稻草的降解作用

为了研究一株蜡样芽孢杆菌(Bacillussp.X10-1-2)对稻草的降解作用,测定了发酵过程中发酵液的纤维素酶和半纤维素酶活、可溶性总糖和还原糖浓度以及底物残渣重、残渣结晶度、傅立叶红外光谱和表面结构的变化.发现在发酵过程中蜡样芽孢杆菌菌体产酶的过程也就是木质纤维素的降解糖化过程.上清液中的纤维素酶活和半纤维素酶活分别在发酵进行到第8 h和20 h时达到最高峰.总糖含量于4 h达到最高值,然后下降到一定程度后保持恒定.还原糖含量随发酵进行不断下降,达到一定值后保持恒定.该菌株对稻草长达5 d的降解过程中结晶度变化十分显著,第3 d时达到最高峰,而后又迅速下降.此菌株对稻草中各组分都有一定降解,其中纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为3.35%、0.91%和2.81%.该菌株主要降解稻草的薄壁细胞,使薄壁细胞发生严重皱缩.这预示,该菌株在造纸工业具有良好的应用前景.     

纳豆芽孢杆菌菌剂的制备工艺

采用单因素及正交试验对纳豆芽孢杆菌发酵培养基、pH、温度、发酵时间等条件进行了考察,利用喷雾干燥法制备菌剂,考察了β-环糊精、蔗糖、可溶性淀粉及脱脂奶粉作为保护剂对菌剂制备的影响,并研究了储藏时间及条件对菌剂发酵活力的影响.研究结果表明:纳豆芽孢杆菌发酵培养基为黄豆浸汁培养基:黄豆以5倍水体积浸泡8~14h,121℃~126℃,0.1~0.15MPa处理1h,滤除黄豆,取豆水,加入5%的葡萄糖和0.02%的K2HPO4,调节pH至7.0;最优发酵工艺:初始pH7.0,37℃发酵10h;喷雾干燥最佳保护剂为5%脱脂奶粉;菌剂4℃冷藏180d以内不影响发酵活力.上述工艺下所制得的纳豆芽孢杆菌菌剂活菌数为6.5×108 CFU/g,发酵生产纳豆激酶性能良好.发酵生产纳豆激酶酶活为2 000~2 200IU/g.本研究为纳豆芽孢杆菌菌剂制备提供了一条较为合理的工艺路线.     

枯草杆菌的分子生物学研究

枯草杆菌是重要的工业生产菌。由于它的非病原性及可将产生的多种酶分泌至胞外的特点,也已成为基因工程重要的宿主菌之一.本文叙述了枯草杆菌中的多种酶基因的克隆及表达。对枯草杆菌作为基因工程的宿主菌应具备的条件、克隆载体的构建和外源基因在枯草杆菌中的表达也做了简介。     

鸟苷产生菌解淀粉芽孢杆菌的选育

出发菌GR001通过形态观察、生理生化实验、16SrDNA同源性序列分析及部分特异性基因序列分析鉴定为解淀粉芽孢杆菌．以GR001为出发菌,通过化学诱变选育出一株遗传标记为腺嘌呤营养缺陷、6-巯基嘌呤抗性以及蛋氨酸亚砜抗性（Ade^-＋MSO^r＋6-MP^r）的突变株GR600．以GR600为受体菌,采用原生质体转化法获得转化子GR607（Ade^-＋MSO^r＋6-MP^r＋km^r）,鸟苷产量高达20．82gm．     

杀镰刀菌素对枯草杆菌致死作用的研究

通过检测OD600、抑菌圈和发酵液澄清度的变化，考察了杀镰刀菌素对枯草杆菌的抑制杀菌作用。实验利用HPF荧光证实杀镰刀菌素致使枯草杆菌细胞内产生氢氧自由基（·OH），添加抗坏血酸（VC）减少·OH的形成，提高枯草杆菌的存活率。应用基因芯片对5min转录变化分析发现sigW调控的基因及胞膜相关基因高表达，用透射电镜观察发现出现空囊体及大量细胞碎片。     

纳豆菌真空冷冻干燥工艺的研究

本文对纳豆菌微生态制剂加工过程中的真空冷冻干燥工艺进行了研究,确定了纳豆菌冷冻干燥的最优工艺参数：冷休克处理条件为8℃、5h;预冻温度为-30℃;冻结物料厚度为10mm;干燥室真空度为30Pa;升华温度为30℃;解析温度为45℃。在以上工艺条件下纳豆菌的冷冻干燥速率为0．83mm／h,存活率可达90．9％。     

病原芽胞杆菌几丁质酶产生菌的筛选与活性鉴定

通过特异引物PCR方法和水解圈活性法对62株苏云金芽胞杆菌菌株、26株蜡状芽胞杆菌菌株及18株球形芽胞杆菌菌株进行了几丁质酶产生菌的筛选。所测苏云金芽胞杆菌中除4株野生型菌株外均为阳性结果,蜡状芽胞杆菌仅1株为阴性结果,球形芽胞杆菌全为阴性结果,且水解圈法观察结果与PCR检测结果一致。在此基础上,通过DNS比色法对几丁质酶产生菌株的几丁质酶比活力也进行了测定。对这些具有致病性的病原芽胞杆菌几丁质酶的研究对于研究其致病机理及对其进行遗传改良具有重要的理论和实际应用价值。