噬菌体随机肽库技术筛选抗CCR5单克隆抗体的识别表位

目的利用噬菌体随机肽库技术筛选趋化因子受体5(CCchemokine receptor 5,CCR5)单克隆抗体的识别表位。方法用抗CCR5单克隆抗体筛选噬菌体随机12肽库,采用双抗体夹心ELISA法鉴定噬菌体阳性克隆,挑取阳性克隆测定DNA序列,推导其氨基酸序列并进行同源性分析。结果从噬菌体随机12肽库中筛选出30株可与抗CCR5单抗特异结合的噬菌体克隆,其中多数克隆呈现核心序列HY-TC-SS-XX-P/FYS-X,该序列与CCR5的一级序列ECL2具有一定的同源性。结论 HY-TC-SS-XX-P/FYS-X序列是抗CCR5单抗的识别表位。     

柯萨奇病毒A组16型抗原表位预测

目的应用模拟表位策略研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)抗原表位。方法分别以具有中和活性的抗CA16单克隆抗体2C6、4F9、1D8为靶分子,在噬菌体12肽库中淘选可与之特异性结合的阳性克隆,对淘选得到的阳性克隆进行序列测定和比对,并采用Phage ELISA法进行特异性鉴定。同时利用生物信息学方法对CA16衣壳蛋白理化性质进行分析,并与阳性噬菌体多肽序列和结构进行比对,预测CA16中和抗原表位。结果经噬菌体12肽库筛选,单克隆抗体2C6、4F9、1D8淘选阳性噬菌体富集率分别为2.39×10~3、1.32×10~4和3.762×10,获得可与单克隆抗体2C6、4F9、1D8结合的阳性克隆分别为10、11、6种,其中各组共有基序分别为K+X+WW和N/Q+S/T+Y/F/W、K+X+WW+D/E、T+X+P+W。Phage ELISA特异性鉴定阳性克隆肽CA1和CB1、FB3和FC3、DA1和DA2、DA5分别强特异性结合单克隆抗体2C6、4F9、1D8。经计算机预测分析,确定了主要位于CA16 VP1 800-810区域,并涉及VP4、VP3上的多个中和表位区域。结论应用模拟表位策略成功筛选出了CA16中和抗原表位,为CA16蛋白抗原结构、新型表位疫苗及诊断试剂的进一步研究奠定了基础。     

单克隆抗体表位分析技术的研究进展

单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性,已广泛应用于自身免疫性疾病、炎性疾病和癌症的治疗。单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于其所识别的抗原表位,确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中的关键步骤。本文主要对几种单克隆抗体表位的分析方法,包括ELISA法、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库、X-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱(hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS)、生物信息学表位预测方法的原理、特点及研究进展作一综述。     

抗银环蛇毒素人源单链抗体的筛选及鉴定

目的从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗银环蛇毒素的人源单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法以银环蛇毒素为靶抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"过程从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性抗体,采用ELISA法检测其结合活性;与抗蛇毒素马血清进行竞争抑制ELISA,检测其中和活性;DNA指纹图谱分析和序列测定确定其抗体类型。结果经4轮筛选,获得了5株对银环蛇毒素具有结合活性的阳性克隆;其中1株结合活性高的单克隆抗体中和活性抑制率可达8.5%;DNA指纹图谱显示为3个不同的ScFv基因,序列分析表明其重链可变区均属于VHⅠ型,轻链可变区分别为VκⅡ、VκⅢ和VλⅡ。结论利用噬菌体抗体库技术获得了具有中和活性的抗银环蛇毒素人源单链抗体。     

人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人源抗狂犬病病毒单链抗体(Single-chain fragment variable,scFv)噬菌体抗体库,并进行筛选。方法以接种过狂犬病疫苗的21份高效价的健康人外周血为原料,提取淋巴细胞总RNA,PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,克隆入噬菌粒pS100,电转化E.coli TG1,建立scFv初级抗体库,并进行基因序列分析及鉴定。以灭活的狂犬病病毒为抗原,进行3轮scFv噬菌体抗体库的富集筛选,随机挑取单克隆,制备噬菌体抗体颗粒,并进行ELISA分析,阳性克隆进行序列分析,采用快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent facus inhibition test,RFFIT)检测噬菌体抗体颗粒的中和活性。结果获得了库容为1.7×108的人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,该抗体库具有较好的序列正确率和多样性,经3轮筛选后,ELISA分析显示,共获得24个序列各不相同的针对狂犬病病毒的阳性克隆,对其中7个克隆的噬菌体抗体颗粒进行RFFIT检测,均具有中和活性。结论已成功构建了人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,并建立了筛选方法。     

噬茵体展示短肽模拟腺病毒表位的研究

目的为了获得含有中和抗体相关的３型腺病毒模拟表位短肽的噬菌体克隆,并观察其对该病毒 感染Ｈｅｌａ细胞的保护效应,为设计新疫苗提供新的思路。方法用３型腺病毒中和抗体筛选噬菌体随机十五肽 库,经三轮筛选后,随机挑取了２２个噬菌体克隆,分别加入３型腺病毒感染的Ｈｅｌａ细胞,用结晶紫染色法观察Ｈｅｌａ 细胞的病变程度。并选择一个有明显保护作用的阳性噬菌体克隆进行测序。结果８／２２个克隆噬菌体短肽对３ 型腺病毒感染 Ｈｅｌｄ细胞具有保护作用。其中一个有明显保护作用的噬菌体短肽的序列为： ｌｅｕ－ Ｖａｌ－ Ｇｌｙ－ Ｉｌｅ－ Ｔｒｐ －Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｌａ,即ＬＶＧＩＷＨＲＬＰＧＡＨＲＧＡ。结论噬菌体短肽可以模拟中和 抗体相关的腺病毒表位,对３型腺病毒感染Ｈｅｌａ细胞有一定的保护作用。     

丙型肝炎病毒人源单克隆抗体的初步筛选

目的构建天然人源噬菌体抗体库,初步筛选人源抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)多肽抗原的单克隆重组噬菌体抗体。方法以健康成人外周血淋巴细胞cDNA为模板,采用PCR技术扩增轻(VL)、重链(VH)可变区基因;重叠PCR法拼接生成单链抗体可变区基因片段(single chain fragment variable,scFv),并克隆至噬菌体载体p CANTAB5e,得到初级抗体库;使用HCV多肽混合抗原,经3轮淘筛富集噬菌体抗体;Phage ELISA法初步筛选HCV重组噬菌体抗体。结果成功构建了天然人源噬菌体抗体库。scFv(VH-κ)库的库容为6.0×10~7 PFU/mL,scFv(VH-λ)库的库容为4.28×10~9 PFU/m L;经初步淘筛,成功获得HCV三级抗体库;Phage ELISA得到了3株候选重组噬菌体抗体。结论初步得到HCV多肽抗原重组噬菌体抗体,为今后进一步筛选高亲和力噬菌体抗体和可溶抗体奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞。强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性。结果经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBV Sczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600。2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应。结论成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料。     

MUC1核心肽多克隆抗体的制备及鉴定

目的　制备MUC1核心肽多克隆抗体 ,用于靶向MUC1肿瘤治疗的研究。方法　以 8R -MUC1核心肽 6重复序列重组蛋白 (8R MUCPT)为抗原免疫家兔 ,以ELISA法确定抗MUC1多克隆抗体效价 ,以Westernblot和ELISA阻断试验鉴定抗体特异性。结果　MUC1核心肽多克隆抗体效价为 1∶2 5 6 0 0 0 ,能与MUC1核心肽特异性结合。结论　利用原核表达的 8R -MUCPT蛋白 ,可有效地诱导免疫动物产生MUC1核心肽特异性抗体 ,为MUC1核心肽靶向肿瘤特异性免疫研究提供了有力的实验材料。     

人源性抗甲型肝炎病毒Fab噬菌体抗体分子的初步筛选

目的从自建的大容量非免疫Fab噬菌体抗体库中筛选具有抗甲型肝炎病毒(HAV)抗原活性的噬菌体抗体,并进行鉴定。方法采用纯化的甲型肝炎病毒作为包被抗原,对自建的容量为1.26×1011pfu/ml的Fab噬菌体抗体库进行筛选和富集,分别对原始库和筛选后的抗体库进行Phage-ELISA和活性检测,经酶切鉴定和DNA测序分析后进行诱导表达。结果经2轮筛选,抗-HAV抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,ELISA检测证实其具有良好的抗甲肝病毒抗原的特异性,抑制率为38.61%。酶切鉴定表明抗体库重组较稳定。SDS-PAGE检测显示Fab抗体蛋白在E.coliDH5α中得到了表达。结论从自建的非免疫Fab噬菌体抗体库中成功获得了抗甲肝病毒噬菌体抗体,所构建的非免疫抗体库可用于人源性抗体的筛选。     

从大容量噬菌体抗体库获取人源性抗角蛋白抗体ScFv及Diabody的构建

目的从大容量噬菌体抗体库筛选人源性抗角蛋白抗体,并构建双体抗体(Diabody)。方法以固相化的角蛋白对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经3～4轮筛选后,挑取克隆,ELISA法鉴定其特异性,并对部分抗角蛋白阳性抗体克隆基因进行DNA序列分析。选取活性好的克隆基因进行改造,构建Diabody表达载体。结果在抗体库的筛选过程中可见明显的富集现象,获得了29株可与角蛋白特异性结合的人源单链抗体,选取4个克隆基因进行序列分析,结果表明,4个克隆的轻链基因均属于λ轻链第1亚群,1号和8号克隆的重链基因属于人IgG第2亚群,6号和29号克隆分别属于第1和第3亚群。从表达抗角蛋白抗体的集落中挑选一个进行基因改造,构建的Diabody表达载体所表达的Diabody活性较高。结论利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗角蛋白抗体,并改造成应用前景较好的Diabody,为开发银屑病治疗性抗体奠定了基础。     

抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。     

鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库的构建及筛选

目的构建鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,并从中筛选特异性的抗体。方法用EHEC O157∶H7 Stx2类毒素免疫BALB/c小鼠,取脾分离淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR分别扩增抗体轻、重链(к和Fd)基因,经双酶切依次克隆入噬粒载体pComb3X中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13K07进行超感染,构建抗EHEC O157∶H7 Stx2的Fab噬菌体抗体库。以纯化的Stx2为抗原进行筛选,获得抗EHECO157∶H7Stx2的特异性Fab抗体,Western blot法检测噬菌体抗体与毒素抗原的结合活性,并对所得阳性克隆进行基因序列分析。结果构建了一个库容为1.56×107的Fab抗体库,筛选出3株特异性较强的阳性克隆,其中2个可与Stx2A1亚单位抗原反应,1个可与Stx2B亚单位抗原反应。基因序列分析显示,轻、重链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白可变区氨基酸序列同源性分别为98.5%和99.6%。结论已成功构建了鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,为进一步制备抗EHECO157∶H7Stx2的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒单克隆抗体的制备

目的制备抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体,为ELISA检测方法的建立奠定基础。方法将Ⅰ型脊髓灰质炎减毒疫苗原液和灭活疫苗原液经超滤、超离纯化,以纯化的减毒脊髓灰质炎病毒D抗原免疫BALB/c小鼠,得到的脾细胞与SP2/0-A14小鼠骨髓瘤细胞融合,以纯化的灭活脊髓灰质炎病毒D抗原建立间接ELISA法,筛选分泌特异性单抗的阳性细胞株,诱生小鼠腹水,通过正辛酸-硫酸铵法纯化抗体,并进行各项鉴定。结果获得两株稳定分泌抗脊髓灰质炎病毒单抗的细胞株7G5及5E4。纯化的7G5和5E4株单抗分别可与脊髓灰质炎病毒D抗原的VP2、VP3衣壳蛋白结合;在不同温度下放置均比较稳定;pH4不利于7G5株单抗的保存;5E4株单抗的相对亲和力大于7G5株;7G5株单抗的亚类为IgM,5E4株单抗的亚类为IgG2a;两株单抗可识别相似表位;7G5株和5E4株单抗的中和效价分别为1:64和1:128。结论已成功制备了两株分泌抗脊髓灰质炎病毒的单抗。     

抗黄曲霉毒素B1重链IgG2b亚型单克隆抗体的制备及应用

目的制备抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的重链IgG2b亚型单克隆抗体,并建立黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA检测方法。方法采用AFB1-BSA偶联物为免疫抗原,AFB1-STI偶联物为检测抗原,利用间接竞争ELISA筛选分泌抗AFB1单抗的细胞株,并对抗体进行鉴定。结果筛选到1株能分泌特异性抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其染色体数目为(90±10)条;所分泌的单抗亚类重链为IgG2b,轻链为λ;间接ELISA检测该株杂交瘤细胞分泌上清效价在1∶12800～1∶25600,纯化腹水效价为1∶105～1∶106。传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;建立的间接竞争ELISA检测方法的最低检出限为0.001ng/ml,校正曲线的线性范围为0.005～5ng/ml,IC50为0.01ng/ml;与AFB1的结构类似物AFM1和化学结构有差异的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的交叉反应率分别为1.4%和<1%。结论所制备的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体具有高度特异性和稳定性,可应用于间接竞争ELISA检测方法。     

仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库的构建及初步筛选

目的构建仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,并进行初步筛选。方法用仙台病毒Tianjin株免疫小鼠,制备脾细胞悬液,提取小鼠脾细胞总RNA,RT-PCR扩增鼠抗体轻链(κ链)和重链Fd基因,将轻链基因和噬菌粒p3MH经SacⅠ和XbaⅠ双酶切后纯化回收,经T4 DNA连接酶连接,电转化E.coli XL1-Blue,构建轻链库;将重链Fd段基因和轻链库p3MH-κ经SpeⅠ和XhoⅠ双酶切后,纯化回收并连接,电转化E.coli XL1-Blue,获得噬菌体抗体库,计算重组率和抗体库滴度。以仙台病毒Tianjin株重组蛋白HN2为抗原进行初步筛选,制备噬菌体抗体,并进行测序。结果构建的免疫噬菌体抗体库库容为1.18×107,重组率为90%,制备的噬菌体抗体滴度为1011pfu/ml;经初步筛选,噬菌体富集了约63.6倍,获得2株与重组蛋白HN2有结合活性的阳性克隆,经NCBI BLAST进行同源性分析,显示为鼠源性抗体,经IMGT分析,显示轻链基因与Vk9亚群基因的同源性为94.87%,重链基因与VH7亚群基因的同源性为97.85%。结论成功构建了仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,为该病毒株的诊断、疾病治疗及致病机制等研究奠定了基础。