基于高通量测序的窖泥原核微生物群落多样性在退化窖池中的空间异质性

采用高通量测序技术结合网络分析及多元统计分析方法,研究退化窖池窖壁上层（PW-T）、中层（PW-M）、下层（PW-U）及窖底（PB）窖泥中原核微生物群落、菌群网络及影响微生物群落的理化因素。结果表明,窖泥微生物群落α及β多样性在退化窖池中均存在明显的空间异质性,且窖池退化是一个自上而下的退化过程。随窖池深度增加,窖泥微生物群落α多样性指数整体呈显著上升趋势,如Shannon指数由大到小依次为PW-U（3.38）＞PB（2.51）＞PW-M（1.09）＞PW-T（0.33）（P＜0.05）;窖泥优势菌门由单一的厚壁菌门（Firmicutes）（PW-T和PW-M,约99%）增加至Firmicutes、拟杆菌门（Bacteroidetes）、广古菌门（Euryarchaeota）等6 个门（PW-U）及PB的4 个门。退化窖泥呈现低含水量（平均值32.7%）、低pH值（平均值4.42）及低有效磷（平均值259.27 mg/kg）“三低”的理化特征,其对窖泥微生物群落结构影响较大（冗余分析）。窖泥菌群网络中互呈正相关的微生物主要隶属于不同的纲（占总相关性的78.74%）。同现网络中9 个枢纽总含量非常低（0%～2.84%）,与窖泥pH值或含水量呈显著或极显著正相关（P＜0.05或P＜0.01）;除互营单胞菌属（Syntrophomonas）外,其他枢纽均与乳酸杆菌属（Lactobacillus）呈极显著负相关（P＜0.01）。窖泥pH值与多种理化因子呈显著正、负相关（P＜0.05）,且与群落Simpson指数呈显著正相关,表明pH值可作为一个综合指标用于窖泥质量的初步判断。本实验较系统地研究了窖泥原核微生物群落多样性在退化窖池中空间分布、微生物之间以及微生物和理化因子之间的相关性,为进一步揭示窖泥的退化机制、防治窖泥退化及人工优质窖泥的制作提供一定的理论支撑。     

基于高通量测序的窖泥原核微生物群落结构及其理化因子相关性分析

为揭示各项理化特性对窖泥细菌群落结构的影响,分析不同年份窖泥的理化因子差异及与其原核微生物群落的相关性。结果表明：20 a窖池池壁和池底窖泥中的水分、pH值、铵态氮及有效磷和速效钾的含量均显著高于2 a窖泥,但其钙含量却显著低于2 a窖泥。30 a池壁和池底窖泥与2 a相比,除水分含量和腐殖质外,其他指标均存在显著差异。理化因子与菌群的相关性分析发现,水分含量、pH值和铵态氮对菌群的影响最为显著,与Lactobacillus呈极显著负相关（P＜0.01）,与Aminobacterium、Syntrophomonas和Sedimentibacter等6 个菌属呈显著正相关（P＜0.05）。新窖泥中不同的微生物菌群在长期往复的发酵过程中相互作用,优势菌属逐步占据主导低位并达到动态平衡,形成优质窖泥。本实验系统研究窖泥原核微生物群落多样性在窖泥老熟及退化过程中的变化趋势,借助微生物和理化因子之间的相关性分析,为窖池的养护机制及优质窖泥的制作提供一定理论依据。     

基于高通量测序的浓香型窖泥原核微生物群落的窖池空间分布

利用Illumina Miseq高通量测序技术解析河南某酒企6年和12年窖泥微生物群落多样性和组成。结果表明,两类窖龄窖池中窖泥原核微生物群落组成具有相似的空间分布特征,且物种丰度（Chao1指数）和多样性（Shannon指数）均分别在窖壁中层和下层窖泥最高;乳杆菌属（Lactobacillus）、产己酸菌属（Caproiciproducens）、嗜蛋白菌属（Proteiniphilum）及甲烷囊菌属（Methanoculleus）等14个属为窖泥优势属,其中78.6%优势属在两类窖龄窖池下部（下层和窖底）窖泥中含量均高于窖池上部（上层和中层）窖泥,且主要隶属于梭状芽胞杆菌纲（Clostridia）和拟杆菌纲（Bacteroidia）;57.6%（19/33）Top10属的空间分布特征与窖龄无关;随窖龄增加,Top10属产生了132个变化,其中75.6%的变化均较小（＜1%）;冗余分析（RDA）结果推测,铵态氮和有效磷可能是影响供试窖泥原核微生物菌群空间分布的主要环境因子。     

浓香型白酒窖池空间位置及窖龄对窖泥原核微生物群落的影响

采用高通量测序技术解析4年和40年窖龄窖池不同部位窖泥原核微生物群落组成,并分析窖泥理化性质差异以及其对原核微生物的影响。结果表明,除总酸外,4年窖龄窖池窖泥样品的平均含水量、pH值、铵态氮含量、有效磷含量和α-多样性指数均低于40年窖龄窖池窖泥,40年窖龄上、中、下、底层窖泥理化性质及α-多样性均相对稳定,且4年和40年窖龄窖池窖泥理化指标的差异主要体现在上层和中层。从门和属水平组成上分析,40年窖龄窖池窖泥样品微生物群落结构相对稳定,且与4年窖龄窖池下层和底层窖泥样品更为相似。冗余分析（RDA）结果表明,总酸、有效磷和pH是影响不同窖龄和不同窖池位置窖泥中优势微生物菌群分布的主要理化因子。     

浓香型白酒窖泥微生物群落多样性及理化因素对其影响

采用Illumina Miseq高通量测序技术解析豫酒某浓香型酒企4年和40年窖池的窖壁、窖底泥原核微生物群落多样性和组成。结果表明,窖泥样品操作分类单元（operational taxonomic units,OTU）数量、Chao1指数和ACE指数没有显著性（P＞0.05）差异,40年窖底泥香农（Shannon）指数和辛普森（Simpson）指数显著性（P＜0.05）偏低。窖泥优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、广古菌门（Euryarchaeota）和放线菌门（Actinobacteria）;优势菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）、产己酸菌属（Caproiciproducens）、不动菌属（Acinetobacter）、理研菌属（Petrimonas）等共12个菌属,隶属于4个门,且集中在厚壁菌门（Firmicutes）。厚壁菌门（Firmicutes）在40年窖底泥中占绝对优势,Bacteroidetes和Euryarchaeota在4年窖底泥和40年窖壁泥中含量都较高;Lactobacillus为40年窖壁、窖底泥第一大优势菌属,而4年窖壁泥和窖底泥第一优势菌属分别为Acinetobacter和Caproiciproducens。冗余分析（redundancy analysis,RDA）显示,总酸（30.7%）和pH值（15.7%）与窖泥优势菌群的相关性最高且显著（P＜0.05）,说明总酸和pH值可能是影响上述不同类型窖泥优势菌群空间分布的主要理化因子。     

地理标志产品宜宾酒窖泥理化特性研究

为进一步分析宜宾酒窖泥微生物群落结构信息及建立宜宾酒窖泥质量标准、稳定生产提供数据,采用理化分析结合仪器分 析对宜宾酒所属酒企的窖泥进行分析。 结果表明,宜宾酒窖泥水分含量主要集中在30.0%～40.0%,pH值呈弱酸性集中在4.0～6.0,铵态 氮含量主要集中在40.0～60.0 mg/100 g,有效磷的含量普遍低于30.0 mg/100 g,腐殖酸的含量在窖池上部及中部主要集中在2.0‰～ 3.0‰,而在窖池底部集中在3.0‰～4.0‰;窖泥有机酸主要集中在窖池底部,乳酸含量高于己酸、乙酸、丁酸;窖池底部的Fe、Ca含量 略低于窖池上部和中部。不同酒企之间的理化指标差异较大。     

凤香型白酒窖泥细菌群落结构分析

窖池中的窖泥作为微生物的主要载体在白酒酿造过程中发挥着至关重要的作用。以凤香型白酒窖泥为研究对象，采用高通量测序技术结合荧光定量PCR法解析窖壁泥和窖底泥中细菌生物量、细菌群落结构及多样性。结果表明：窖泥中细菌的生物量在108～1010copies/g窖泥之间，窖底泥中细菌的生物量高于窖壁泥。窖壁泥和窖底泥中细菌群落的丰富度差异不大，结构组成存在差异。窖壁泥、窖底泥中检测的细菌种群可分别归属于34个、37个细菌门，各有4个、6个优势细菌门，其中厚壁菌门Firmicutes为绝对优势细菌门，相对丰度分别是64%、65%；可分别归属于719个、627个细菌属，各有10个、12个优势细菌属，其中乳杆菌属Lactobacillus为窖壁泥中绝对优势细菌属，相对丰度达45%,Caproiciproducens为窖底泥中第一优势细菌属，相对丰度达22%。     

高温曲应用于窖池养护的实践研究

窖泥质量的优劣直接影响着浓香型白酒的产质量及酒体风格,而长时间使用的窖泥因诸多因素会出现窖泥退化,故需要采取一定的措施进行窖池养护。将高温曲用于窖池养护,可使窖泥腐殖质含量提高0.63%以上,己酸菌数量增加3.39×105个/g以上,实验窖池所产原酒中己酸乙酯含量提高43.11 mg/100 m L以上,乙酸乙酯含量降低29 mg/100 m L以上,显示了高温曲用于窖池养护,在延缓窖泥老化及提高窖池所产原酒理化指标方面的有益作用。     

应用PCR-DGGE技术分析不同性状窖泥的细菌群落结构

基于聚合酶链式反应-变性梯度凝胶（PCR-DGGE）技术分析了不同性状窖泥的细菌群落DGGE指纹图谱,结果表明,通过DGGE指纹图谱能够区分新窖泥、窖壁泥和窖底泥,其中以窖壁泥退化前后图谱变化最明显。PCR-DGGE图谱优势条带测序结果显示,窖泥中细菌微生物包括拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、变形菌门4类,其中新窖泥微生物种类最丰富,涵盖以上门类,特有优势微生物为Enterobacterale科、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）及里氏杆菌属（Riemerella）。紫单孢菌科（Porphyromonadaceae）仅存在于窖底泥中,Tumebacillus属微生物只存在于窑壁泥中。通过窖泥的DGGE图谱对比分析,能够对窖泥类型做出初步判定,并能及时发现窖泥退化现象,为工厂窖泥培养、检测和窖泥优化提供了理论支持。     

江西李渡酒业明代古窖窖泥微生物的研究

对江西李渡酒业明代古窖与新窖窖泥微生物种类与数量、窖泥理化指标及原浆酒理化指标进行研究。研究结果表明:明代窖窖泥微生物总数高于新窖窖泥,分别为5.57×107cfu/g、5.88×106cfu/g;明代窖窖泥中主要细菌、霉菌、酵母菌、放线菌均多于现代窖;新窖窖泥中甲烷菌未检出;明代窖窖泥感官指标明显优于新窖窖泥,腐殖质、有效钾、有效磷含量高于新窖窖泥,而水分、p H低于新窖窖泥;明代窖窖池原浆酒的酒精度、总酸、总酯含量高于新窖窖池原浆酒,而固形物含量低于新窖窖池原浆酒。研究表明,窖池窖龄对大曲酒产量和质量有一定影响。窖龄的延长使得功能菌不断富集,产生丰富的代谢产物,使得大曲酒产量和品质得到不断提升。     

基于高通量测序的宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥细菌群落结构分析

以宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥为研究对象,采用Illumina Miseq高通量测序技术和典范对应分析（CCA）等方法探究细菌菌群结构变化特征及其环境影响因素。结果表明,16年窖龄窖泥的细菌群落结构多样性高于6年窖龄窖泥,相同窖龄、同一窖池的窖底泥高于窖壁泥。6年窖壁泥与窖底泥的细菌群落结构相似,绝对优势细菌属均为乳酸菌属（Lactobacillus）。16年窖壁泥与窖底泥的细菌群落结构差异较大,共有绝对优势细菌属为梭菌属（Clostridium）、氨基酸杆菌（Aminobacterium）、理研菌属（Petrimonas）、互营单胞菌属（Syntrophomonas）和Sedimentibacter。特有绝对优势细菌属中Lactobacillus相对丰度的降低以及Clostridium和Aminobacterium相对丰度的迅速增长均表明16年窖池已成为趋于老熟化的优质窖池。CCA分析结果推测,pH和有机物可能是影响16年窖池细菌群落结构改变的主要环境因子。     

酱香型郎酒高温大曲、酒醅和窖泥中细菌群落结构分析

该研究利用高通量测序技术对酱香型郎酒大曲、酒醅和窖泥的细菌菌群进行多样性解析和比较分析。结果表明,郎酒窖泥中细菌菌群的丰富度和多样性最高,大曲中细菌菌群的多样性远高于酒醅。窖泥中主要优势细菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）（26.1%）、埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）（12%）、梭菌属（Clostridium）（7.9%）等,嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）作为主体菌,同时存在多种未培养菌种;大曲中的主要优势菌群包括泛菌属（Pantoea）（21.9%）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）（21.4%）、克罗彭施泰特氏菌属（Kroppenstedtia）（19.4%）和乳球菌属（Lactococcus）（9.4%）等;酒醅中主要优势细菌属为片球菌属（Pediococcus）（42.7%）、魏斯氏菌属（Weissella）（32.1%）、芽孢杆菌属（Bacillus）（14.2%）和乳杆菌属（Lactobacillus）（8.3%）,乳酸菌占据优势地位。     

明光酒业人工窖泥配土培菌规模化制作技术

窖泥是生香功能微生物重要载体,决定着浓香型白酒风格。首先开展了老窖泥、黑土原料、黄土原料的化学成分检测分析,指标包括有机物及有机元素、大量矿物元素、重金属元素,以指导人工窖泥配土工作,培养传承有明光白酒风格的特色窖泥。通过比较发现,黑土原料、黄土原料均可用于窖泥的原料,指标显示黑土原料是优选。以黑土原料、黄土原料为原料,配方中均需大量补充有机物。老窖泥、黑土原料、黄土原料中铬、铅、铜等重金属含量极低,无重金属食品安全风险。项目循环培养了300余吨的窖泥复合窖泥微生物,菌液产酸产气,菌膜肥厚,培养7d^9d菌液可使用。项目规模化制作了800m3窖泥,分三轮进行。培养的人工窖泥,水分含量40.1±1.6%、pH 5.71±0.1、铵态氮53.6±3.0mg/100g干土、有效磷66.1±5.3mg/100g干土、有效钾102.5±5.4mg/100g干土,己酸菌为106数量级,己酸含量3.44±0.3mg/g干土。感官观察,人工窖泥呈灰黑色,手感细腻,黏附力大,品质良好,有典型己酯、丁酯味,无臭味异味。     

新老窖泥细菌群落结构差异及其对酿造白酒质量的影响

该实验选取六尺巷酒厂产酒质量低的新窖池窖泥及附近酒厂产酒质量良好的成熟老窖池窖泥,提取总脱氧核糖核酸（DNA）,对细菌16S rRNA的V3-V4区基因进行扩增、高通量测序后分析群落结构的差异。结果表明,螺旋菌门（Spirochaetae）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）是不同浓香型白酒生产厂窖泥样品（标记为YRF、XJF及CXF）中的共有优势微生物;梭菌纲（Clostridia）是成熟窖泥中的绝对优势微生物;在窖泥细菌的系统发育多样性上,新窖泥样品（标记为LCX）中梭菌纲与芽孢杆菌纲（Bacilli）的相对丰度显著低于成熟窖泥,是新窖池产酒质量比成熟老窖池差的主要原因。对窖泥细菌群落结构的分析有助于揭示浓香型白酒质量的成因。     

浓香型白酒窖泥的真核菌群结构分析

本研究采用Illumina高通量测序分析浓香型白酒新老窖池池壁泥与池底泥真核菌群结构。老窖池底泥的6个样本中只有1个样本扩增并测序成功,说明老窖池池底泥真菌含量非常少。门水平上,窖泥的绝对优势门均为Ascomycota(98.80%～63.14%),新老池底泥真菌组成更相似,新老池壁泥真菌组成更相似。属水平上,新窖池底泥中Candida占绝对优势(82.79%),老窖池底泥中只有Candida(97.24%),新老池壁泥的真菌组成更接近且更丰富,优势属包括Candida(11.99%vs 3.72%)、Pichia(3.69%vs 5.09%)、Aspergillus(4.87%vs 4.41%)等。老窖池底泥的p H值(5.69)、铵态氮(2.54 g/Kg)、乙酸(689.97 mg/Kg)和K+(1252.19 mg/Kg)含量最高;新窖池底泥总酯(7.12 mg/g)最高。聚类分析显示池底泥真核菌群的聚类效果更集中。冗余分析(RDA)表明,Ca2+与池底泥真核菌群呈强烈正相关,解释度最高(45.9%),具极显著贡献(p0.01),说明Ca2+含量对池底泥的真核菌群组成具有重要作用。     

窖泥中挥发性物质和微生物群落的空间分布规律及其关系

为了研究窖泥中的微生物和挥发性物质的空间分布规律,本文采用固相微萃取法偶联气相色谱-质谱联用法对窖泥中的主要挥发性物质成分进行定性定量分析,并利用Illumina MiSeq测序分析窖泥中的微生物群落组成。结果表明,窖泥中的挥发性物质成分主要以酯类和酸类物质为主,占比达到73.01%~98.36%,随着窖池深度的增加而不断增加。窖泥样品中的原核微生物共检出10门,15纲,21目,42科,64属,门水平上优势菌群占细菌总数的98.86%~99.93%,厚壁菌门为绝对优势菌群。Shannon指数从2.130增加到4.970,Simpson指数从0.557增加到0.932,ACE指数和Chao1指数在池底部最高,分别为114.523和114.50。α-多样性表明,池壁下部和池底部窖泥中的微生物菌群丰度和多样性高于池壁上部和中部,这与挥发性物质的种类和含量分布规律相吻合。梭菌属和甲烷菌属等优势菌属是进行微生物代谢和种间物质交换、产生重要香气物质及其前体的主要微生物,并随着空间深度的增加,不断反应和富集,形成与窖泥的空间位置密切相关的规律。空间差异性是导致窖泥不同空间位置原核微生物菌群和挥发性物质成分存在差异性的重要原因。