谷氨酰胺合成酶腺苷酰化位点的定点突变和产胺的初步研究

为解决谷氨酰胺合成酶腺苷酰化修饰失活的问题,利用基因定点突变的方法将谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase, GS)腺苷酰化位点由Tyr405突变为Phe405,并在大肠杆菌中获得突变后GS的表达. 对比腺苷酰化位点突变前后的重组大肠杆菌pET-3a/GSI和pET-3a/GSIM在高氨环境下的GS活性和谷氨酰胺产量,发现重组菌pET-3a/GSIM在高氨环境下的最大酶活是150 U/L,产谷氨酰胺浓度为17.5 g/L,分别是pET-3a/GSI酶活(30 U/L)的5.0倍和产谷氨酰胺水平(3.4 g/L)的5.1倍,GS定点突变使谷氨酸转化为谷氨酰胺的途径得到强化.     

酶法转化谷氨酰胺

高产谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌经酶解和超声波处理后，释放出高活性的谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，简称GS). GS的胞外催化反应受各种反应条件和因素的影响. 通过单因子实验、响应面实验和正交实验发现，反应混合物中最显著的影响是腺三膦(ATP)，当ATP浓度在40~50 mmol/L时，催化作用达到最高；同时酶量对反应也有较大的影响. 研究了粗酶液在细胞外反应时各种因素对谷氨酸棒杆菌GS催化作用的影响，获得了体外酶催化反应的适宜条件，最高转化产生的谷氨酰胺可达7.1 g/L，转化率达到94.8%.     

利用荧光素异硫氰酸酯检测季铵盐阳离子表面活性剂的方法

使用荧光素异硫氰酸酯（FITC）实现了对季铵盐阳离子表面活性剂（QAS）在水溶液中临界胶束浓度（CMC）的准确测量及其在CMC以下的浓度定量。用该法测得十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）在水中的CMC分别为12～13 mmol·L^-1和0.70～096 mmol·L^-1,与电导率法、表面张力法和芘荧光法的检测值相近。对DTAB和CTAB的检测下限分别是011 mmol·L^-1和1.7 μmol·L^-1,定量范围分别为0.11～9.73 mmol·L^-1（0.034～3.0 g·L^-1）和1.7 μmol·L^-1～0.27 mmol·L^-1（6.2×10^-4～0.1 g·L^-1）。结果表明,使用FITC荧光探针检测QAS具有安全、简便、灵敏度和准确度高的优点。     

基于膜分离技术的生物聚合铁的制备

开展基于膜分离技术优化反复序批式工艺制备生物聚合铁（BPFS）的技术研究。考察了应用聚偏氟乙烯中空纤维微滤膜（PVDF）对微生物的分离效果,Fe^2+的生物催化氧化速率,制备周期及膜的污染与处理的情况。研究表明,PVDF膜可有效分离微生物,显著提高原液中的生物量。在优化工艺的基础上,制备了全铁含量分别为60、80、100 kg·m^-3 BPFS,Fe^2+的生物催化氧化速率分别达到1.75、1.85、1.43 g·L^-1·h^-1,制备周期分别为15.5、21、40 h,比工艺优化前分别缩短了38%、42%、18%,反应液中的生物量达到10⁸ 个·ml^-1数量级。实验中发现,随着分离次数和全铁含量的增加,膜污染加剧,膜通量下降;采用0.2 mol·L^-1的草酸钠和0.2 mol·L^-1硫酸的混合溶液对PVDF膜进行清洗,可基本清除膜表面的污染物,满足分离要求。     

铌酸光催化降解甲基橙溶液

以铌酸为光催化剂,在高压汞灯照射下,对模拟染料废水甲基橙溶液进行光催化降解,研究过氧化氢加入量、催化剂用量和甲基橙起始浓度对光催化降解的影响。结果表明,当甲基橙起始浓度为15 mg·L^-1、30%过氧化氢用量为5.0 mL·L^-1和催化剂用量为1.5 g·L^-1时,光照1 h,甲基橙溶液降解率达到97％,在较低浓度下,甲基橙溶液的光催化降解反应符合一级动力学方程。     

酶法制备γ-D-glutamyl-L-tryptophan的动力学模型

以酶法合成γ-D-glutamyl-L-tryptophan (γ-D-Glu-L-Trp)为研究体系,采用D-谷氨酰胺为γ-谷氨酰基供体,L-色氨酸为受体,测定得到了转肽反应的米氏常数（K _m）为5.11 mmol·L^-1,催化常数（K_cat）为3.92 mmol·min^-1,γ-D-Glu-L-Trp的水解反应米氏常数（K′_m）为2.31 mmol·L^-1,催化常数（K′_cat）为1.46 mmol·min^-1。采用顺序反应机制建立了酶法制备γ-D-Glu-L-Trp的过程动力学模型,并进行了参数优化。经验证,所建模型可准确预测该体系中的反应进程,模型数值解与实验值的平均相对误差小于5%。     

生物转化制备D-谷氨酰胺的研究

报道了制备D-谷氨酰胺的一种新方法,即利用大肠杆菌AS1.505的L-谷氨酰胺脱羧酶立体选择性地将D,L-谷氨酰胺中L型对映体降解为4-氨基-丁酰胺,分离得到D-谷氨酰胺。同时考察了转化体系温度、pH等因素对L-谷氨酰胺脱羧酶活力的影响。实验结果表明最佳条件为:温度37℃,转化体系pH=4.8,菌体质量浓度5 g/L,吐温-80质量浓度0.15 g/L,菌龄14 h,底物质量浓度40 g/L。L-谷氨酰胺脱羧酶在最适转化条件下比酶活可以达到4 200 U,L-谷氨酰胺在8 h内完全转化成4-氨基-丁酰胺,D-谷氨酰胺收率达到理论收率的92%。     

产1,3-丙二醇新型重组大肠杆菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD)的构建及其转化甘油

利用温控载体pHsh将编码甘油脱水酶的基因dhaB和编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD串联构建重组质粒pHsh-dhaB-yqhD, 将其转化大肠杆菌得到新型产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109(pHsh-dhaB-yqhD), 并对影响该重组菌发酵的营养因子进行研究.实验结果表明：该重组菌转化甘油合成1,3-丙二醇的适宜培养基组成为甘油60 g·L^-1、酵母膏5.0 g·L^-1、维生素B₁₂ 0.05 g·L^-1以及KH₂PO₄ 7.5 g·L^-1; 以此培养基在5 L发酵罐上进行放大, 1,3-丙二醇产量、转化率和生产能力分别达到43.26 g·L^-1、72.2 %和1.55 g·L^-1·h^-1.     

有机相中酶催化1-苯基乙胺的不对称酰胺化反应

在有机相中,对酶催化条件下的1-苯基乙胺酰胺化反应进行了研究。通过对酰基供体、酶、溶剂的筛选和酯量、底物胺浓度、酶量、摇床转速、反应温度等影响因素的考察,发现乙酸异丙烯酯为较佳的酰基供体,脂肪酶Novozym 435对该反应的催化活性和对映体选择性较高,甲苯为最适的介质,最适酯量为底物胺量的0.6倍,最佳底物胺浓度、酶量、摇床转速、温度分别为200 mmol·L^-1、4 mg·ml^-1、200 r·min^-1、30℃。在此优化条件下反应的对映体选择率（E）达到89。反应4 h转化率为39％,产物的对映体过剩值（ee_p）为96％;反应10 h转化率达到52.4％,底物的对映体过剩值（ee_s）为98％。     

共固定化细胞协同糖化发酵纤维素原料产乳酸

为提高纤维素原料对乳酸的转化率,将富含纤维二糖酶的黑曲霉（Aspergillus niger ZU-07）孢子和德氏乳酸杆菌（Lactobacillus delbrium）细胞共固定在海藻酸钙凝胶珠中,将共固定化细胞体系与纤维素原料的酶水解相耦联,组建成新型串联式生物反应器。研究表明,共固定化细胞中的纤维二糖酶可将纤维素水解液中的纤维二糖迅速转化成葡萄糖,而葡萄糖又能被乳酸杆菌迅速转化成乳酸,从而解除了纤维二糖及葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用。当酶解罐和共固定化细胞反应柱的温度分别控制在50 ℃和48 ℃,共固定化细胞反应柱的装填量为40％时,串联式生物反应器中生成的乳酸浓度和纤维素对乳酸的转化率分别达到55.7 g·L^-1和91.5%。采用分批添料工艺,乳酸终浓度和反应器生产效率分别提高到106.7 g·L^-1和1.270 g·L^-1·h^-1,而单位底物的纤维素酶用量降低了25%。     

微胶囊固定化克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇

引 言 1,3-丙二醇是合成新型聚酯材料--聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)的单体.近几年,利用微生物法生产1,3-丙二醇已成为国内外研究的热点[1-2].     

添加表面活性剂对α-熊果苷发酵的影响

探讨了不同表面活性剂对嗜麦芽黄单胞菌BT-112(Xanthomonas mahophilia BT-112) 催化合成α-熊果苷的影响。通过比较不同种类、不同浓度的表面活性剂及其加入时间，实验得出最佳表面活性剂为Tween80，最适反应条件为：Tween80浓度为3 g·L^-1，加入时间为12h，流加次数为3次，每次浓度1 g·L^-1。在此条件下对苯二酚的转化率为96.2 %，菌体对对苯二酚的最大耐受度为60 mmol·L^-1 ,分别比空白提高了3.53%和25.0%，发酵周期为36h，比空白缩短了25%。     

重组柠檬酸杆菌合成紫色杆菌素的工艺条件优化

以L-色氨酸为前体物,对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)基因工程菌株生产紫色杆菌素的工艺条件进行了优化。通过单因素实验研究了培养基种类、培养温度、碳源、溶氧、种子液的状态、接种量、诱导时机、诱导剂的浓度及初始pH对细胞生长和紫色杆菌素产量的影响,通过正交实验研究了这些因素中可能存在交互作用的4个因素(种子液OD660、接种量、诱导时机、诱导剂浓度)的影响主次,确定了这些因素、水平的最佳搭配方案。结果表明,重组柠檬酸杆菌合成紫色杆菌素的最优培养条件为:种子液培养至OD660=3.6时,以3%的接种量接种于以甘油为碳源、初始pH为6.5的磷酸盐发酵培养基E2(25μg.ml-1卡那霉素),先在37℃、200r.min-1下培养至OD660=1.4,然后加入0.5μl.ml-1的诱导剂正辛烷,同时转入20℃,在150r.min-1下诱导培养31h。在此最优条件下,紫色杆菌素粗提物(紫色杆菌素及脱氧紫色杆菌素的混合物)产量可达1.809g.L-1,比优化前(0.514g.L-1)提高了252%,是目前国际上其他研究小组报道的最高摇瓶产量(0.43g.L-1)的4.2倍。质粒稳定性实验结果表明重组柠檬酸杆菌在抗生素选择压力条件下具有良好的遗传稳定性。     

搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响

研究了透明质酸的流变学特性以及搅拌和混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响。结果表明：透明质酸溶液属于典型的非牛顿凯松流体;搅拌转速和透明质酸浓度对气液传氧速率有很大影响;在较高的搅拌速率下发酵时可以得到较高的透明质酸产量,650 r·min^-1时透明质酸产量为4.1 g·L^-1,产率系数为0.08 g·g^-1;用有效搅拌模型分析发酵过程发现,只有在高搅拌转速时发酵体系才处于全部混合状态。     

利用甘蔗糖蜜半连续发酵生产琥珀酸

为获得较高的琥珀酸发酵产量和生产强度,对Actinobacillus succinogenes CGMCC1593两级双流半连续发酵甘蔗糖蜜生产琥珀酸的工艺过程进行了研究。通过对一级罐初始总糖浓度、补加培养基体积分数和批次发酵时间等发酵条件的优化,琥珀酸产量较分批发酵36 h提高12.9％,与补料分批发酵结果接近;生产强度较分批发酵和补料分批发酵分别提高111％和114%。     

原位氮饥饿发酵工艺中梯度补氮对谷氨酰胺合成酶的调控

The effects of uniform and gradient fed nitrogen on glutamine synthetase (GS), glutamate dehydrogenase(GDH) and glutamate synthase ((K)GAT)were investigated in glutamine production by fermentation of Corynebacterium glutamicum NS611 after 3 h of in-situ nitrogen starvation. It was shown that the strain in the later growth phase entered naturally into in-situ nitrogen starvation by controlling the initial concentration of urea and the biomass was slightly decreased. The pH value reached 6.5 again in the culture system, which confirmed the beginning of nitrogen starvation in the culture system. After 3 h nitrogen starvation the activity of GS was increased over two folds and the time of high activity of GS persisted three folds longer in the gradient fed nitrogen system than that in the normal fed batch. The higher activity of GDH was also maintained. The glutamine production increased by 72 % than the original technology of nitrogen starvation and the time of fermentation was shortened by above 12 h.     

重组大肠杆菌HT02高密度高表达HT-1融合蛋白发酵过程优化

发酵工艺放大是将实验室成果产业化的必要一环,随着发酵规模的扩大,工艺流程也会有相应的调整,导致微生物所处的生长环境以及生长代谢状态的改变,从而影响大体积发酵罐的发酵水平。本文以一株产HT-1融合蛋白的重组大肠杆菌HT02为研究对象,在200 L发酵罐中研究了分批补料培养时菌体生长与HT-1融合蛋白表达的特性,通过采用提前诱导、增加接种量的手段,解决了因增加二级种子培养工艺而导致的200 L发酵罐中HT-1融合蛋白表达水平下降的问题,最终使菌体密度、HT-1融合蛋白表达水平、融合蛋白细胞得率以及融合蛋白体积得率分别达到55.1 g·L^-1、27.4%、0.056 g·(g cell)^-1和3.103 g·L^-1,较工艺改进前发酵水平分别提高了9.8%、23.4%、14.3%和25.2%,实现了在200 L发酵罐中高密度高表达发酵,为HT-1工业化生产提供了指导。     

丙酮酸分批发酵的供氧控制模式

以一株光滑球拟酵母的多重维生素营养缺陷型为研究菌株,考察了分批发酵中不同体积传氧系数(KL_a)对其产丙酮酸性能的影响.高KL_a(450 h^-1)下,丙酮酸产率较高(0.797 g·g^-1),但葡萄糖消耗速度较慢(1.14 g·L^-1·h^-1);低KL_a(200 h^-1)下,葡萄糖消耗速度快(1.97 g·L^-1·h^-1),然而丙酮酸产率(0.483 g·g^-1)却明显下降.根据发酵过程主要参数和碳流分配的变化特性提出了发酵前16h控制KL_a为450h^-1、16h后控制KL_a为200 h^-1的分阶段供氧控制模式,结果实现了高产量(69.4 g·L^-1)、高产率(0.636 g·g^-1)和高葡萄糖消耗速度(1.95g·L^-1·h^-1)的相对统一,丙酮酸生产强度(1.24g·L^-1·h^-1)比控制KL_a恒定为450、300和200h^-1的过程分别提高了36％、23％和31％.实验数据表明,供氧良好状态下细胞产丙酮酸性能出现的差异可能是由维生素处于亚适量水平时酵解产生的NADH去路不同,导致细胞处于不同的能量水平而引起的.