野生型与突变型钝齿棒杆菌生物合成精氨酸基因簇arg JBDFR的生物信息学比较

本文设计四对特异性引物分别扩增了野生型和突变型钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇argCJBDFR,对其中发生突变的基因argJ、argB及argF的变化进行了生物信息学比较,并分析了这些突变可能对精氨酸产量提高的贡献,为采用基因工程手段改良菌种提供有益的信息和指导。     

钝齿棒杆菌产精氨酸关键酶分析

采用亲和层析和SDS-PAGE方法分析钝齿棒杆菌产精氨酸关键酶。实验表明此菌产精氨酸关键酶之一是乙酰谷氨酸激酶，其分子量为34kD：同时另一分子量为49kD的蛋白质亦对精氨酸有较高的亲和性，揭示钝齿棒杆菌产精氨酸的代谢途径中受精氨酸抑制的酶不是唯一的。实验对限速酶之一——乙酰谷氨酸激酶的酶学性质做了初步研究，结果显示，此酶的最适反应温度为49℃，最适pH为8．0；金属离了Pb^2 、Cu^2 、Mn^2 和Fe^2 对乙酰谷氨酸激酶有强烈的抑制作用：DTT对该酶的活力有一定的影响。     

吐温对钝齿棒杆菌产L-精氨酸代谢的影响

目的:以课题组构建的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT NAGK M4 △proBANcgl1221AdtsR1(CCM01)为出发菌株,探究吐温(Tween)对该菌产精氨酸代谢的影响.方法:优化精氨酸发酵及Tween质量浓度,测定菌体生长量、L-精氨酸产量、发酵液残糖量考察Tween ...     

一株联产L-精氨酸和聚羟基丁酸酯的重组钝齿棒杆菌的构建

Corynebacterium crenatum SYPA 5-5是一株用于L-精氨酸(Arg)生产的工业菌株。聚羟基丁酸酯(PHB)是在细菌内部形成的聚合物,将PHB代谢途径引入细胞内可影响胞内的全局代谢网络,实现联产PHB和相关化工产品如琥珀酸、L-谷氨酸和L-色氨酸等。采用基因工程技术,将来源于Ralstonia eutropha H16的PHB合成基因簇phb CAB导入到L-精氨酸生产菌株C.crenatum SYPA 5-5中,进行组成型表达,旨在获胞内产PHB、胞外产L-精氨酸的效果,对出发菌和重组菌分别进行5 L容积发酵罐实验,并对发酵相关参数进行测定分析。结果表明,由于PHB合成基因簇的导入,重组菌中PHB质量为细胞干质量的12.8%,实现了胞外产L-精氨酸、胞内产PHB的效果,并发现胞内PHB的积累对菌体生产L-精氨酸有一定的正向作用,发酵96 h,L-精氨酸的产量达到43.21 g/L,相比于出发菌提高了20%。     

解除硝酸盐呼吸和氮通量限制对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响

精氨酸广泛应用于食品、医药和工业领域中,其生产方式主要是微生物发酵法。钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)是精氨酸生产的重要工程菌株。该文针对课题组前期构建的钝齿棒杆菌(CCM01)进行代谢改造,探究了arnR和cgl2482的敲除对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响。采用无痕敲除方法构建工程菌株并对其进行摇瓶发酵,测定菌体生长量、L-精氨酸产量、葡萄糖消耗量考察菌株产L-精氨酸的影响。硝酸盐能提高钝齿棒杆菌在氧气不足时的生长率,并且arnR的敲除有助于L-精氨酸的生产,arnR敲除菌株CCM02较对照菌株产量提高了8.58%,且当硝酸盐浓度在1.5 mmol/L时对积累L-精氨酸最为有利,产量达到17.09 g/L;cgl2482的敲除有助于氮源流入精氨酸合成途径,其敲除菌株CCM03精氨酸产量达到了17.88 g,较对照提高了4.9%;最终在CCM03发酵中添加1 g/L的尿素、50 g/L的谷氨酸钠以及1.5 mmol/L的硝酸盐时,L-精氨酸产量达到22.25 g/L,较CCM01提高了46.8%。     

钝齿棒杆菌产精氨酸代谢途径中argB基因的扩增及其序列分析

根据GenBank报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032序列,设计并合成一对引物,获得了全长argB基因片段.将其克隆到pGEM T Easy载体中,经测序鉴定后,以其为DIG标记探针,通过SouthernBlot分析钝齿棒杆菌A.S1.542与谷氨酸棒杆菌ATCC13032,argB基因核苷酸同源性高达99%,氨基酸序列95%相同.     

前体物质和碳氮源补加策略对钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸的影响

研究了前体物质和碳氮源补加策略对钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYAN7发酵生产L-精氨酸的影响.结果表明,发酵24 h后添加前体物质谷氨酸,以初始硫酸铵质量浓度20 g/L,分别于24、48 h补加20 g/L硫酸铵的补氮方式,和以初始葡萄糖质量浓度100 g/L,分别于24、48、72 h均匀添加葡萄糖,使总糖质量浓度达175 g/L的补碳方式,摇瓶发酵96 h后,L-精氨酸产量最高达37.8 g/L.     

基于钝齿棒杆菌argGH启动子改造的L-瓜氨酸高效合成

L-瓜氨酸是尿素循环的重要中间体,在argGH编码酶的催化下易分解为L-精氨酸,在微生物体内难以大量积累。作者通过启动子替换手段,以弱启动子P-dapAB6替换调控argGH表达的启动子P-argG,构建了弱化L-瓜氨酸分解代谢途径的重组菌株Corynebacterium crenatum H-7-PdapAB6:argGH。重组菌株的转录水平和酶活力结果显示,重组菌株分解途径中argG和argH的基因表达水平下调,精胺琥珀酸合成酶ASS(argG编码)和精胺琥珀酸裂解酶ASL(argH编码)酶活分别降低91.80%和55.35%。摇瓶发酵结果表明,L-瓜氨酸的产量、糖酸转化率和生产强度分别为33.85 g/L、0.25 g/g和0.34 g/(L·h),较原始菌株分别提高了4.91、5.00和4.86倍。通过启动子替换策略,构建了L-瓜氨酸分解代谢途径弱化的工程菌株,初步实现了L-瓜氨酸的高效合成。     

氧化还原电位调控对钝齿棒杆菌代谢通量分布的影响

研究不同氧化还原电位对钝齿棒杆菌厌氧发酵特性的影响,并对菌株的代谢通量分布特征进行了分析。结果表明,氧化还原电位由－56 mV降为－400 mV时,发酵液中琥珀酸质量浓度由14 g/L上升为20.2 g/L,乳酸质量浓度由44.9 g/L下降为35.2 g/L。代谢通量分析结果表明,降低氧化还原电位对6-磷酸葡萄糖与磷酸烯醇式丙酮酸节点处的代谢流分布影响显著。氧化还原电位为－400 mV时,胞内戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway,HMP）代谢通量与－56 mV相比增加了1.74 倍,由磷酸烯醇式丙酮酸流向C4途径的代谢通量与－56 mV相比增加了78%,琥珀酸通量由31.73 mmol/（L·g·h）增加到56.53 mmol/（L·g·h）,乳酸代谢通量由159.73 mmol/（L·g·h）下降为133.50 mmol/（L·g·h）。研究结果表明6-磷酸葡萄糖与磷酸烯醇式丙酮酸节点是影响钝齿棒杆菌厌氧发酵产琥珀酸的关键节点,为后期通过菌种改造以调节乳酸和琥珀酸的生成比、实现乳酸与琥珀酸联产奠定了基础。     

钝齿棒杆菌AS1.998原生质体形成与再生条件的研究

研究了影响L-异亮氨酸(L-Isoleucine)产生菌钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.998原生质体形成和再生的各个因素。结果表明:菌体培养至对数生长期,0.8 U/mL青霉素G处理3 h后,1.0mg/mL的蛋清溶菌酶37℃,150 r/min酶解15 h,原生质体形成率可达98.0%以上,在含8.5%蔗糖的再生完全培养基上,再生率可达20.0%～30.0%。     

缺失ATP合酶和插入VHb基因对钝齿棒杆菌谷氨酸产量的影响

为了提高钝齿棒杆菌生产谷氨酸的产量,以谷氨酸生产菌钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）T6-13为出发菌株,利用同源重组技术使其缺失ATP合酶基因（atp）并进一步插入透明颤菌血红蛋白基因（VHb）,得到两株重组菌株T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb,通过检测重组菌株谷氨酸产量及生长情况可以看出,在发酵32 h后,atp基因缺失菌株较出发菌株谷氨酸产出累积量高27.76%,但atp基因缺失导致菌体生长缓慢且无法到达出发菌株稳定期浓度,而插入VHb基因的atp基因缺失菌株的谷氨酸产出累积量较出发菌株高36.91%,且菌体的生长速率及稳定期浓度与出发菌株基本一致。     

烟草绿原酸合成关键基因NtHQT1的克隆及表达分析

绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)是烟叶中含量最高的多酚类物质,羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶(Hydroxycinnamoyl-Co A quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT)是植物绿原酸合成代谢途径中的关键酶。为研究HQT基因在烟草绿原酸合成中的作用机制,通过同源克隆技术从烟草中克隆到一个新的HQT基因,命名为Nt HQT1。生物信息学和激素处理后基因表达模式分析结果表明:Nt HQT1 c DNA全长1 305 bp,编码435个氨基酸,Nt HQT1定位在细胞质中,属于疏水性蛋白,其二级结构主要是螺旋和无规则卷曲;茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、生长素(3-Indoleacetic acid,IAA)、独角金内酯类似物(GR24)、细胞分裂素(6-Benzylaminopurin,6-BA)和赤霉素(Gibberellic acid,GA)能明显上调Nt HQT1基因的表达,脱落酸(Abscisic acid,ABA)对基因表达没有明显作用,预示Nt HQT1基因在烟草生长发育和抗病等生物学过程中发挥重要作用。      

一株后生元菌株的抑菌特性研究及其细菌素基因簇的挖掘

本文旨在筛选一株可拮抗中国大鲵源嗜水气单胞菌的后生元菌株,并对其进行抑菌特性的研究和细菌素基因簇的挖掘。以中国大鲵病原性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila, Ah2）为指示菌,筛选一株产细菌素乳酸菌株并评估其药敏特性;采用有机溶剂萃取法初步纯化菌株产细菌素;通过pH、温度和消化酶耐受性、贮藏稳定性、抑菌谱及最小抑菌（MIC）和杀菌浓度（MBC）共六类指标评价细菌素的抑菌特性;溶血反应与细胞毒性实验测试细菌素对Ah2的抑菌效果,经扫描电子显微镜初步探究细菌素的抑菌机制;经由紫外全波长扫描定性细菌素以及Tricine-SDS-PAGE电泳测定细菌素的分子量范围;最后根据菌株的全基因组序列挖掘其潜在的细菌素基因簇（RiPPs）。结果显示,从青岛市售腐乳中筛出一株产细菌素植物乳植物杆菌M4L1（Lactiplantibacillus plantarum M4L1）。初步纯化M4L1产细菌素并命名为LP01。细菌素LP01具备良好的消化酶耐受性,且在pH2~10、?20~121 ℃和9个月贮藏期内均表现出稳定的抑菌活性,并对单增李斯特菌、弗氏柠檬酸杆菌等14株革兰氏阳性和阴性菌均有不同程度的抑制作用;另外,LP01对Ah2的MIC和MBC分别为12.94和25.88 μg/mL。经MBC浓度的LP01处理后的Ah2,溶血活性和细胞毒性均得到明显缓解;SEM观察其通过破坏Ah2的细胞壁具有抑制或杀伤作用。LP01在波长200~220 nm处的肽类特征吸收峰显著,电泳后条带显示其分子量在3.3~4.0 kDa,LP01为小分子肽类细菌素。此外,基因注释到M4L1有2个细菌素基因簇（RiPPs）,对应产物分别为Plantaricin K和Plantaricin E,均属于植物乳杆菌II类细菌素。菌株M4L1不仅含有多种抗菌物质相关基因簇,而且其细菌素LP01具备了优良的抑菌性能,能有效抑制多种水产病原菌、食物腐败菌及食源性致病菌等。产细菌素植物乳植物杆菌M4L1作为一株潜在的后生元菌株具有较好的应用前景。     

服装D2C2M众设个性定制生态链平台研究

本文通过对我国传统服装产业链生产模式及转型升级方向的研究,提出D2C2M个性定制生态链平台的必要性及可行性,结合大数据、互联网技术等提出C2M平台建设的技术路线,指出要串联设计师、工厂、制造商、经销商和用户终端,构建具备短路经济效应的生态平台。     

变形假单胞菌吡咯喹啉醌合成基因簇的克隆与分析

从变形假单胞菌JUIM01中克隆到吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因簇,阐明了其基因组成和生物学信息。根据已报道的假单胞菌的基因组进行简并引物设计,采用LA-PCR技术克隆变形假单胞菌的PQQ合成基因簇,对克隆的基因片段进行测序并使用生物信息学方法进行综合分析。结果表明:克隆到的基因片段全长为11 659 bp,其中包括pqqF、pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqM、pqqH和pqqI共9个基因,编码PQQ生物合成的前体短肽PqqA和合成途径的相关酶;这些基因与荧光假单胞菌Pf0-1的PQQ合成基因簇的基因组成类似,相应基因的序列一致性达41%～94%。本研究中首次从变形假单胞菌中克隆到PQQ合成基因簇,并对其进行生物信息学分析,为变形假单胞菌的PQQ生物合成途径和胞内再生机制的研究奠定了基础,进而为提高2KGA的生产强度提供了理论支撑。     

Streptococcus thermophilus IMAU20551胞外多糖基因簇及其表达分析

以1 株产胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）IMAU20551为研究对象,提取其DNA后采用Illumina HiSeq技术对DNA进行二代基因组重测序,并利用SOAPdenovo软件对其进行组装,通过与RAST、直系同源集、基因本体论、京都基因与基因组百科全书等数据库进行比对,注释基因组中功能基因。发现S. thermophilus IMAU20551基因组全长1 725 107 bp,共注释出1 884 个功能基因,其中包含一个长度为19 376 bp的完整eps基因簇,该基因簇中与EPS合成相关的基因共有18 个,主要包括epsA、epsB、epsC、epsD、epsE、eps1F、eps2F、epsJ、wzx、epsP和epsX等,这些基因分别对EPS的合成、组装以及转运输出进行调控。另一方面,利用实时聚合酶链式反应对S. thermophilus IMAU20551 eps基因簇表达进行验证,发现所有基因均可表达,且除个别糖基转移酶基因外,其他被测基因均在6 h达到最大表达量。本研究介绍了S. thermophilus IMAU20551的基因组特征、eps基因簇及其表达能力,为今后深入研究S. thermophilus EPS基因簇及其表征结构的互作关系奠定基础。