苦荞过敏原TBa 的表位突变及免疫活性鉴定

前期研究曾分离获得一种纯度均一的天然苦荞过敏蛋白(tartary buckwheat allergen a,TBa ),免疫检测发现其为苦荞中的主要过敏原。本实验采用定点突变的方法对得分较高的表位E1 的基因进行分子改造,构建5 个突变体L39R、L42R、L47R、V52R、L54R。在大肠杆菌BL21 中分别进行表达,经Ni2+-NTA 亲和纯化后得到纯度较高的重组突变体蛋白。ELISA 和点杂交检测发现,与突变前的E1 相比,突变体L42R、L47R、L54R 的免疫活性明显降低,这表明Leu42、Leu47、Leu54 在TBa 的过敏性中起着至关重要的作用。     

鸡蛋过敏原表位研究进展

鸡蛋过敏是一种常见的食物过敏反应,是人体对鸡蛋中蛋白质成分产生的一种变态反应。食物过敏反应的物质基础是抗原表位与抗体对位,解决食物过敏反应问题的关键一点即需要深入研究出过敏原的表位。本文介绍了鸡蛋中6种主要过敏原,简述了过敏原表位的定位方法,并详细综述了卵白蛋白、卵类粘蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的过敏原表位研究进展。本文可为进一步鸡蛋过敏研究提供理论指导,也可为表位成分的定量检测以及无毒副作用鸡蛋过敏原疫苗的开发等方面提供一些参考。      

食物过敏原构象性表位鉴别的研究进展

构象性表位是表位的重要组成之一,在过敏反应中起重要作用。表位定位工作是过敏原研究的重要领域。目前应用于构象性表位研究的方法主要有3类:基于线性表位的氨基酸组成和特性预测构象性表位;利用噬菌体筛选得到模拟肽,通过生物信息学定位构象性表位以及利用光谱学等方法测定构象性表位与抗体结合的相关参数确定构象型表位。前两种方法比较常用,而光谱学方法是近年来发展的一种新方法,准确性更高。这3类定位方法可为过敏原的研究提供认识和了解构象性表位的途径,并为构象性表位在过敏中的作用机制提供部分理论依据。     

生物信息学技术在食物过敏原表位预测中的应用

表位是过敏原与抗体结合的物质基础。基于生物信息学技术的表位预测包括线性表位预测和构象性表位预测。其中线性表位预测主要是基于过敏原蛋白的理化性质进行预测;构象性表位预测主要包括基于蛋白结构信息和结合噬菌体展示技术的两大类预测。利用生物信息学技术预测食物过敏原表位主要应用在牛乳、鸡蛋、鱼、甲壳类水产动物等动物性食物过敏原和花生、大豆、小麦、果蔬类等植物性食物过敏原方面。     

牛奶过敏原制备方法的研究和免疫活性鉴别

目的探索牛奶主要过敏原的制备工艺。方法采用等电点沉淀、凝胶层析和分子筛等技术纯化牛奶中主要过敏原组分;采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,采用双抗原夹心-ELISA鉴定免疫活性。结果成功获得牛奶中的四种主要过敏原组分:酪蛋白、β乳球蛋白、α乳白蛋白和分子量较高的P1组分,并经过免疫实验证实这四种组分均能与过敏血清产生反应,而其中β乳球蛋白和P1组分反应性较高。结论本研究探索出一种简单、实用的牛奶主要过敏原制备工艺,并证实牛奶中的β乳球蛋白和高分子量蛋白质为主要过敏原。     

花生Ara h6基因的克隆、表达以及免疫活性鉴定

目的:克隆花生主要过敏原Arah6基因,诱导表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Arah6的基因,将测序正确的片段连入原核表达载体pET-28a上,并转入BL21（DE3）宿主表达菌中,IPTG诱导表达,通过Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白,Western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明花生Arah6目的片段全长为438bp,编码145个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。该基因诱导表达的产物纯化后经SDS-PAGE鉴定为17kDa。Western-blotting结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆花生过敏原Arah6的基因,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。      

小麦主要过敏原CM16线性B细胞表位的预测及初步鉴定

目的：探究小麦主要过敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16的线性B细胞表位。方法：通过提取小麦蛋白粗提物,进行体外模拟胃肠道消化,发现小麦过敏原中具有消化抗性的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16的片段;进一步通过生物信息学方法分析CM16的一级氨基酸序列、二级结构,并通过同源建模确定CM16的三级结构。结果：利用生物信息学法预测出CM16的4 条线性B细胞表位后,结合质谱得到的抗消化肽段信息进行比对分析,发现其中2 条肽段存在部分重合,也证明了生物信息学分析鉴定过敏原线性B细胞表位方法的可行性和应用性。结论：通过生物信息学预测小麦过敏原CM16线性B细胞表位有助于进一步认识小麦过敏原,对小麦过敏原的识别和检测具有重要的参考和借鉴作用。     

大豆蛋白过敏原结构与功能的研究进展

大豆是优质的植物蛋白资源,但同时也是八大食物过敏原之一。大豆蛋白中Gly m Bd 28K,Gly m Bd 30K（P34）和β-伴大豆球蛋白的α亚基Gly m Bd 60K被普遍认为是大豆中的主要致敏原。本文综述了大豆蛋白主要过敏原的结构、功能及其过敏原表位的研究进展。      

腰果过敏原Ana o 2结构及抗原表位预测

腰果是引起人们过敏的主要食物之一。作者采用生物信息学方法,通过Pubmed网络服务器、生物信息分析软件SOPMA、swiss-model网络服务器、DNAStar生物分析软件等对腰果主要过敏原Ana o 2的结构和抗原表位进行预测,分析Ana o 2蛋白的抗原表位可能是108-111,181-186,217-218,234-238,244-255,283-287。这为腰果过敏原的进一步研究提供理论参考,并对开发低过敏腰果制品提供帮助。     

坚果类过敏原的分离及免疫印迹分析

本文采用传统的丙酮、乙醚溶剂去脂方法,选用不同品种和不同种类的坚果食品对其进行过敏蛋白的初步分离,应用BCA蛋白试剂盒测定各蛋白浓度,通过SDS-PAGE电泳分离坚果过敏蛋白各组份,采用免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定坚果蛋白的过敏性。结果表明,各坚果蛋白提取浓度为白芝麻:14 mg/mL,黑芝麻:4 mg/mL,核桃:8 mg/mL,腰果:28 mg/mL,开心果:21 mg/mL。SDS-PAGE电泳显示15 ku是白芝麻的主要蛋白,34 ku是黑芝麻的主要蛋白,19和37 ku是腰果的主要蛋白,13 ku是核桃的主要蛋白,13和21 ku是开心果的主要蛋白。Western-Blotting显示对过敏患者的阳性混合血清均有过敏反应,坚果过敏具有同源性,白芝麻与黑芝麻的主要过敏原分子量均在22 ku,腰果的主要过敏原分子量在20 ku,核桃的主要过敏原分子量在54 ku,开心果的主要过敏原分子量在23 ku。     

苦荞过敏蛋白全长基因的克隆、表达及免疫学活性研究

荞麦属于一种常见的植物性过敏原。本实验在以往研究的基础上,以苦荞种子总RNA 为模板,通过RTPCR和5'-RACE 等方法,扩增、克隆获得苦荞过敏蛋白全长cDNA 序列。分析表明,该序列编码一个由515 个氨基酸残基组成的功能蛋白,并与甜荞过敏性贮藏蛋白的氨基酸序列同源性达到90% 以上。经原核表达及一步亲和纯化后得到纯度较高的重组苦荞过敏蛋白(rTBt)。采用竞争性ELISA 对其免疫活性分析显示,目的蛋白与荞麦过敏病人血清中的IgE 抗体可以特异结合。     

荞麦过敏原特异性抗体酶联免疫吸附法检测试剂制备

以天然苦荞过敏蛋白包被聚苯乙烯微孔板,以鼠抗人IgE抗体标记辣根过氧化物酶,以间接酶联免疫吸附法(indirect enzyme-linked immunosorbent assay,IELISA)检测病人血清中的特异性抗体,分析并建立关键操作步骤及反应条件。结果表明:ELISA反应的最适工作条件为包被的抗原质量浓度100μg/mL、阳性血清稀释度1:50、酶标二抗稀释度1:1000,37℃时封闭的最佳时间为40min,包被抗原与阳性血清中抗体的最佳作用时间为40min,阳性血清与酶标二抗的最佳作用时间为40min。本方法具有良好的特异性、重复性和精密度。     

苦荞纳豆酱的抗氧化活性

为研究苦荞纳豆酱总黄酮和总酚的体外抗氧化活性,测定DPPH自由基清除率、ABTS+·清除率、·OH清除率、O2－·清除率和Fe3+还原能力,并且与黄豆酱、甜面酱进行抗氧化活性比较研究。结果表明：苦荞纳豆酱的DPPH自由基清除率、ABTS＋·清除率、·OH清除率、O2 － ·清除率均高于黄豆酱和甜面酱;Fe3+还原能力略低于甜面酱。被测样品的抗氧化活性与总黄酮、总酚的含量有显著相关性（P＜0.01）。     

苦荞调控糖脂代谢作用及其生物学机制研究进展

目前,苦荞因具有调节糖脂代谢的功效已日渐成为研究热点,其主要化学成分包括多种氨基酸、脂肪酸、维生素以及黄酮类物质。以苦荞饮食替代日常饮食,有助于降低血糖、血脂水平,改善胰岛素抵抗等。苦荞中的苦荞黄酮、苦荞蛋白等成分被认为与改善糖脂代谢相关,其主要通过抑制α-葡萄糖苷酶活性、增加胰岛素敏感性等作用机制达到改善糖代谢的作用,并通过吸附胆酸盐、调控血脂代谢通路等机制达到改善脂代谢的作用。本文综述了苦荞调节糖脂代谢的物质基础及作用机制研究,并对未来苦荞的研究方向和应用前景进行了分析,以期促进苦荞的深入研究和应用,为肥胖、高血脂、2型糖尿病等慢性疾病的预防和早期治疗提供新思路。     

苦荞米与苦荞粉加工中营养功能成分的评价及利用

苦荞米与苦荞粉加工中各组分主要营养功能性成分的对比分析结果表明,传统制粉工艺中,营养功能性成分主要富集于麸皮,蛋白质和黄酮含量分别高达23.88% 和6.58%,但利用率仅为34.57% 和13.65%,而按蒸谷米工艺加工的苦荞香米和全营养苦荞米,其营养功能成分含量显著(p ＜ 0.01)高于苦荞粉,蛋白质和黄酮的利用率可达78.95%～89.58% 和66.44%～77.78%,同时还形成了较多的抗性淀粉,含量分别为4.68% 和6.84%。因此,苦荞米比苦荞粉具有更佳的营养价值和保健功能。     

苦荞黄酮的纯化及抗氧化活性的研究

利用AB-8大孔吸附树脂对苦荞黄酮提取物样品进行纯化,利用薄层色谱分析了纯化前后苦荞黄酮的成分变化,并以维生素C为参照,比较了纯化前后苦荞黄酮对O2-·和DPPH·体外清除能力。试验结果表明:经过AB-8纯化后,苦荞黄酮提取物2中黄酮的含量由78.42%提高到98.73%,纯化后主要成分为芦丁;其清除O2-·的半数清除浓度IC50由0.099 mg/mL升高到0.123 mg/mL,纯化后清除能力反而降低;清除DPPH·的IC50由0.273 mg/mL降低到0.185 mg/mL,清除能力有所提高。     

苦荞保健茶开发研究

苦荞麦营养成分独特,现代医学表明苦荞麦在治疗高血压、冠心病、糖尿病、防止内出血、抗癌、延缓衰老等方面具有独特的营养和药用价值。该研究以苦荞籽粒加工过程中总黄酮含量、芦丁含量、抗氧化性、感观质量为指标,对苦荞保健茶加工工艺进行探讨,得出最佳加工工艺。     

苦荞黄酮类化合物的稳定性研究

目的研究苦荞黄酮类化合物的稳定性。方法用分光光度法研究储存时间、光照、加热、pH值、食品添加剂、氧化剂、还原剂和金属离子等条件对苦荞麸皮中类黄酮化合物的影响;比较了两种提取方法获得的黄酮提取物在上述条件下的稳定性。结果苦荞黄酮溶液在暗处存放60 d无变化,但光照能破坏其结构;苦荞黄酮溶液耐热性强,90℃保温1 h不受影响;在酸性条件下苦荞黄酮溶液稳定,在中性、碱性环境中不稳定,碱性对其有强破坏作用;常用食品添加剂在安全使用量范围内,柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、蔗糖对苦荞黄酮稳定性无影响,苯甲酸钠对其有一定的影响,氧化剂H2O2对其稳定性无明显影响,还原剂Na2SO3对其有强烈破坏作用;金属离子K+、Na+、Ca2+、Mg2+对苦荞黄酮稳定性无明显影响,Cu2+、Fe2+、Al3+对其影响较大,Fe3+影响最大。结论各因素对苦荞黄酮2#提取物的影响较1#提取物大,即1#提取物的稳定性略高于2#提取物。     

苦荞凝集素的纯化及性质鉴定

目的：从苦荞麦种子中提取、纯化苦荞凝集素,对其凝血及酶学活性等性质进行初步研究。方法： 采用缓冲液抽提、硫酸铵沉淀、透析及DEAE-纤维素阴离子交换层析（DEAE fast flow,DEAE FF）纯化凝集素;高碘酸希夫（periodic acid-Schiff,PAS）染色鉴定其蛋白种类,硫酸-苯酚法测定糖含量;凝血实验和糖抑制实验检测其凝血活性和结合糖特异性;以对硝基苯磷酸二钠为底物,测定磷酸酯酶活性。结果：从苦荞麦种子中获得了一种具有凝血功能的蛋白质--苦荞凝集素（tartary buckwheat lectin,TBL）。纯化的TBL在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）图谱上显示单一条带,根据SDS-PAGE计算其分子质量约为62 kD。PAS染色证明TBL为糖蛋白,糖含量为5.8%。凝血实验表明TBL对人的O型血红细胞具有特异性凝集作用,效价为15 μg/mL,对其他血型的红细胞没有凝血效应。血凝活性被D-甘露糖和D-葡萄糖抑制,推测其是一种甘露糖结合凝集素。酶学性质鉴定显示,TBL具有磷酸酯酶活性,米氏常数Km= 9.86×10－3 mol/L。结论：TBL可能是苦荞麦种子中的一种具有多种酶学功能的甘露糖凝集素