沉默乏氧诱导因子-1α和生存素基因联合放疗对裸鼠移植人肝癌的抑瘤效应

为探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)乏氧诱导因子-1α(Hypoxia induced factor1α,HIF-1α)和生存素(Survivin)基因联合X射线照射对裸鼠移植人肝癌细胞SMMC-7721的抑瘤效应,肿瘤局部注射脂质体包裹的靶向HIF-1α和/或Survivin基因的RNA干扰质粒后,接受5Gy X射线照射。观察各组裸鼠治疗后不同时间肿瘤体积和平均存活时间,以免疫组化染色法检测肿瘤组织Survivin、HIF-1α、增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)表达和肿瘤间质微血管密度,以TUNEL法检测肝癌细胞凋亡。结果表明,治疗开始后第9-21天,双干扰联合放疗组裸鼠肿瘤体积显著小于单干扰联合放疗组,且平均生存时间明显延长。治疗结束后1天,双干扰联合放疗组裸鼠肿瘤组织Survivin、HIF-1α、PCNA表达和肿瘤间质微血管密度明显低于对照组和放疗组,双干扰联合放疗组移植瘤凋亡细胞百分数较其它组明显升高。结果提示,双干扰联合放疗可有效地抑制裸鼠移植人肝癌细胞增殖和血管生成,促进细胞凋亡,其抑瘤效应明显优于放疗和单干扰联合放疗。     

miR-210反义慢病毒对乏氧人肝癌细胞放射敏感性的影响

为探讨miR-210表达下调对乏氧人肝癌SMMC-7721细胞放射敏感性的影响,利用分子生物学技术构建miR-210反义和随机寡核苷酸慢病毒载体,经慢病毒转染建立稳定转染miR-210反义和随机寡核苷酸的人肝癌SMMC-7721细胞株。以实时定量RT-PCR检测乏氧SMMC-7721细胞HIF-1αmRNA表达和miR-210表达,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,克隆存活实验检测细胞放射敏感性变化。结果表明:SMMC-7721细胞乏氧培养后,HIF-1α和miR-210表达随时间逐渐增加,稳定转染miR-210反义寡核苷酸能明显下调miR-210在乏氧细胞的表达;下调miR-210表达明显抑制乏氧SMMC-7721细胞体外增殖活性(P<0.05;P<0.01),诱导G1期阻滞(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.01),提高乏氧SMMC-7721细胞放射敏感性,放射增敏比约为1.21。结果提示,下调miR-210表达可抑制乏氧SMMC-7721细胞体外增殖,诱导凋亡,增强其放射敏感性。     

沉默生存素基因增强人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性

为探讨沉默生存素(Survivin)基因对人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性的影响,利用靶向Survivin基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)质粒pGenesil-survivin,采用阳离子脂质体介导法转染SMMC-7721细胞后48 h,分别以RT-PCR和Western blot法检测Survivin基因mRNA和蛋白表达,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,克隆存活实验检测细胞放射敏感性的变化。结果表明,转染质粒pGenesil-survivin后48 h,SMMC-7721细胞Survivin基因mRNA和蛋白表达水平与对照和阴性干扰组相比明显降低(p0.05);转染后第1—4 d,细胞增殖活性与对照组相比明显降低(p0.05或p0.01);转染后48 h,细胞阻滞于G2/M期(p0.001),凋亡百分率明显高于对照组(p0.001);转染后SMMC-7721细胞D0值减小,放射敏感性增强,增敏比为1.24。结果提示,沉默生存素基因可增强人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性。     

STAT3抑制剂WP1066对乏氧人脑胶质瘤细胞U251放射敏感性的影响

采用CoCl2处理U251细胞模拟细胞乏氧,用甲基四唑蓝(MTT)法检测U251细胞活力的改变;RT-PCR和Western blot检测HIF-1α在U251细胞中的mRNA和蛋白水平的表达;克隆形成法检测X射线照射下不同处理组的克隆形成率。结果表明,100μmol·L-1 CoCl2处理及100μmol·L-1 CoCl2与0.5μmol·L-1 WP1066联合处理U251细胞24 h无明显细胞毒性作用(p0.05);CoCl2诱导HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平上调,WP1066抑制HIF-1α在蛋白水平的表达;与空白对照组相比,CoCl2组的克隆形成能力明显上调(p0.05),CoCl2与WP1066联合处理组克隆形成能力明显下降(p0.05)。WP1066可增加乏氧U251细胞放射敏感性,其机制可能是通过抑制STAT3通路降低HIF-1α的表达而发挥放射增敏作用。     

辐射对肝癌细胞中乏氧诱导因子-1α的影响及机制研究

研究辐射对肝癌细胞中乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）的调控作用。采用氯化钴（CoCl2）化学模拟乏氧,诱导HepG2肝癌细胞内HIF-1α稳定表达,再进行不同剂量的γ射线照射,观察照射后细胞内HIF-1α表达的变化,同时,利用荧光显微镜和流式细胞术（flowcytometry,FCM）对细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量进行检测。结果显示,在乏氧条件下HepG2细胞受1—5Gyy射线照射后,细胞内HIF-1α的表达与辐照剂量呈正相关。在1—3Gyy射线照射后,细胞内活性氧的含量与HIF-1α的表达呈负相关。此研究提示,辐射可增强乏氧细胞内HIF-1α的表达水平,活性氧含量的降低可能与这一调控作用有关。     

放疗后早期肿瘤组织内^99Tc^m-rh-Annexin V分布与Survivin、Caspase-3蛋白表达的相关性研究

采用^99Tc^m-rh-Annexin V作为凋亡显像示踪剂,观察小鼠放疗后早期肿瘤组织内Survivin、Caspase-3蛋白表达。结果显示,放疗组肿瘤组织内^99Tc^m-rh-Annexin V分布、TUNEL检测阳性细胞数及Caspase-3蛋白表达均明显多于对照组,Survivin蛋白表达A组明显高于B组,差异均存在显著性（P均＜0．01）。相关性研究表明,肿瘤组织的放射性摄取与TUNEL阳性细胞数呈明显正相关（r=0．942,P=0．000）;肿瘤组织内Survivin蛋白表达与Caspase-3蛋白表达呈明显负相关（r=-0．836,P=0．000）。肿瘤组织内^99Tc^m-Annex-inV分布与Caspase-3蛋白表达呈明显正相关（r=0．948,P=0．000）,与Survivin蛋白表达呈明显负相关（r=-0．819,P〈0．01）。以上结果提示,肿瘤组织内^99Tcm—rh—Annexin V的分布可以反映放疗后早期肿瘤组织细胞凋亡的状况以及凋亡调控蛋白Survivin、Caspase-3表达水平的变化。     

三种肿瘤细胞对γ射线辐射敏感性的比较

选取对数期生长细胞接受0～6Gy^60Coγ射线照射。用克隆形成法检测细胞的存活率，并比较三种细胞的D50（细胞存活分数为50％时的剂量），以衡量细胞的辐射敏感性。同时，以α/β值作为标准衡量了三种细胞的修复能力并与各自的辐射敏感性进行了对比。结果显示，在0～6Gy剂量范围内，三种细胞的辐射敏感性呈现一定差异，在相同的剂量照射下，SMMC-7721细胞的存活分数最高，而A375细胞的存活分数最低。从剂量-存活曲线可以计算出SMMC-7721、HeLa和A375三种细胞的D50分别为2．3、1．9和1．2Gy；其α/β分别为0．36、2．35和5．6。表明三种细胞的辐射敏感性由高到低依次为A375、HeLa、SMMC-7721，而其修复能力由高到低依次为SMMC-7721、HeLa、A375。     

乏氧显像和乏氧干预在32P间质内放疗中作用的实验研究

核素内放疗已越来越多应用于临床,预测、增敏其疗效具有实际应用价值.本研究对荷S180瘤小鼠在32p肿瘤间质内注射治疗前行99mTc-HL91乏氧显像,并用Carbogen吸入进行乏氧干预,结果显示99mTc-HL91肿瘤滞留量在Carbogen吸入后明显减少,同时32p肿瘤间质内注射治疗后Carbogen吸入组小鼠肿瘤大小明显小于空气吸入组;但是,99mTc-HL91肿瘤滞留量多少与32p肿瘤间质内注射治疗后肿瘤大小间无明显相关性.说明99mTc-HL91乏氧显像可以反映乏氧干预效果,但不能预测32p肿瘤间质内注射治疗疗效,而Carbogen吸入可以提高32P肿瘤间质内注射治疗疗效.     

肿瘤乏氧靶向性基因治疗增强放射治疗的实验研究

乏氧是实体肿瘤组织微环境中的一个重要现象,乏氧肿瘤细胞对放射治疗、化学治疗的耐受性增强,乏氧肿瘤细胞的存在是恶性肿瘤患治疗失败、复发和转移的重要原因之一。乏氧细胞的基因表达与正常细胞有着很大的差异,然而,这些差异使针对肿瘤乏氧细胞的靶向性治疗成为可能。本研究利用乏氧细胞自身的特点,构建乏氧依赖性表达的腺病毒载体,借助该载体引导自杀基因BCD(细菌胞苷脱氨酶,     

白藜芦醇对肺癌A549细胞的放射增敏作用及其机制研究

摘要采用MTT法检测不同浓度白藜芦醇对肺癌A549细胞的毒性;克隆形成实验测定白藜芦醇对A549细胞增殖抑制作用;碱性单细胞凝胶电泳实验（彗星实验）检测细胞DNA受损情况;采用Westernblot法检测白藜芦醇与辐射联合作用对抑制凋亡蛋白Survivin的影响。结果表明,白藜芦醇对肺癌A549细胞的抑制作用随着白藜芦醇浓度升高及时间延长而增加：白藜芦醇与辐射联合作用可以明显增加辐射所致A549细胞的DNA损伤（p〈0．05）,并降低克隆形成率及抑制凋亡蛋白Survivin的表达。表明白藜芦醇对A549细胞具有放射增敏作用,且放射增敏作用可能是通过抑制Survivin蛋白的表达实现的。     

99Tcm-HL91在体外乏氧心肌细胞中的动力学观察

采用原代培养心肌细胞，观察其摄取与清除^99Tc^m-HL91的情况，并测定心肌细胞的活力。结果表明：乏氧组心肌细胞仍存活，其摄取^99Tc^m-HL91较正常组明显增高（P＜0.05），清除相对缓慢，但尚无明显差异；180min时，乏氧组心肌细胞内^99Tc^m-HL91的存留量是正常组的3.0倍，可用于探测心肌细胞乏氧。     

曲古菌素A增强食管癌细胞系EC9706对X射线的辐射敏感性

利用流式细胞仪及荧光定量PCR技术,分别检测细胞凋亡率和DNA损伤修复相关基因mRNA表达变化,以探讨曲古菌素A（Trichostatin A,TSA）能否在体外增强食管癌细胞对X射线的敏感性。结果显示,辐射前TSA的处理显著提高了X射线引起的细胞凋亡率（P〈0．05）;X射线的单独处理显著上调了基因ATM、XRCC2和Lig4（8Gy除外）的mRNA水平（P〈0．05）,TSA单独和TSA联合X射线都下调了ATM、XRCC2和Lig4的mRNA水平。提示TSA很可能通过下调ATM、Lig4和XRCC2mRNA水平使食管癌细胞对X射线敏感。     

电离辐射所致肾损伤引起的骨代谢异常的机制探讨

研究了大剂量γ射线照射大鼠肾脏后诱发骨代谢异常的细胞分子机制。以15Gyγ射线照射大鼠肾脏,3个月后分析骨骼的病理形态、相关基因mRNA和蛋白质表达量的改变。肾辐射致骨小梁体积、骨小梁宽度、骨小梁数目分别降低13．2％、18．3％（p〈0．05）和20．1％（p〈0．05）,骨小梁间距增加34．8％（p〈0．05）,骨吸收表面提高20．2％（p〈0．05）。骨骼RANKL／OPG（细胞核因子κB受体活化因子配基,Receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand,RANKL;骨保护蛋白,Osteoprotegerin,OPG）mRNA比值提高52．2％（p〈0．05）。TGF—β（转移生长因子β,Transforming growth factor-β）、IGF-Ⅰ（胰岛素样生长因子Ⅰ,Insulin—like growth factor Ⅰ,）、OPN（骨桥蛋白,Osteopontin）mRNA和蛋白质表达量明显升高。结果表明：大剂量γ射线照射大鼠肾脏可导致明显骨代谢异常,其发生机制主要与肾1α羟化酶活性降低致活性维生素D减少及PTH升高,成骨细胞表达的RANKL／OPG比例失调,以及TGF—β、IGF—Ⅰ、OPN表达明显升高有关。     

新型乏氧显像剂99Tcm-N4IPA的制备及小鼠体内外乏氧选择性研究

目的 探求结构简单、易于标记、性能优良的新型乏氧显像剂。方法 用锝标记新型乏氧配体N4IPA（1-（4-硝基咪唑-1-）丙醛羟氨基化合物）,用TLC及HPLC法对标记物进行质控,并检测标记物的体外稳定性、脂水分配系数、血液清除情况,最后通过体外细胞摄取实验及荷瘤动物体内分布研究了解标记物在乏氧细胞和肿瘤组织中的聚集情况。结果 标记物的放化纯度>90%,脂水分配系数2.71±0.05（n=3）,为亲脂性;在室温、37℃及37℃+人血白蛋白3种情况下均较稳定。体外细胞摄取实验表明：加入标记物后1-4h,乏氧体系中CHO细胞对标记物的摄取百分数均高于相应的非乏氧体系（p<0.05）,且乏氧体系中CHO的摄取百分数随时间延长而逐渐增高。血液清除实验表明：99Tcm-N4IPA在正常小鼠体内的血液清除符合二室代谢模型,其分布相半衰期为15 min,消除相半衰期为10.2 h。荷脑胶质瘤U87裸鼠显像及体内分布数据表明：标记物主要经肾脏排泄,还有部分经肝肠途径排泄。标记物在肿瘤内有一定聚集,其2 h及4 h的瘤/血分别为1.57±0.31和1.98±0.25,而瘤/肌肉分别为11.89±1.64和13.11±1.47。结论 99Tcm－N4IPA具有乏氧选择性,可使肿瘤清晰显影,有望成为一种新的肿瘤乏氧显像剂,但尚有待于进一步研究。     

电离辐射对体外培养肾小管上皮细胞1α羟化酶表达的影响

研究电离辐射对体外培养肾小管上皮细胞1α羟化酶表达的影响。采用实时荧光定量（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,Real—time Q—PCR）技术与透射电镜等方法,观察3Gy、5Gy和10Gy ^137Csγ,射线单次照射（剂量率为0．85Gy／min）体外培养肾小管上皮细胞后1α羟化酶mRNA表达水平及细胞线粒体形态的改变,并与不受照（0Gy）组比较。结果表明,低剂量（3Gy）γ射线照射24h后即出现肾小管上皮细胞1α羟化酶mRNA表达水平的明显降低（p〈0．05）,且随受照剂量的增加下降幅度增大;电镜观察显示受照后肾小管上皮细胞线粒体呈现肿胀、基质变薄、电子密度减低、嵴断裂、数量减少与排列紊乱等变化。     

99Tcm-HL91乏氧显像预测高压氧放疗增敏的可行性

目的99mTc-HL91乏氧显像预测高压氧对肿瘤的放疗增敏情况。方法40只荷H22肝癌小鼠均分为4组,每组10只;①对照组,不进行高压氧治疗,其中5只行99mTc-HL91乏氧显像,5只行照射治疗;②15分钟组;③30分钟组;④60分钟组,后3组小鼠按高压氧后不同时间顺序,其中5只行99mTc-HL91乏氧显像,其余5只行照射治疗。各组显像小鼠通过核医学感兴趣区（regionfinteresting,ROI）技术,计算肿瘤与对侧相应部位放射性比值（T/NT）。图像采集结束后立即处死小鼠,完整剥离肿瘤,称重并计算放射性计数,计算肿瘤微分摄取率（DUR）。各组照射治疗小鼠均记录肿瘤照射后生长天数及小鼠平均存活时间。结果 与对照组比较,15分钟组、30分钟组DUR值、T/NT值、肿瘤及小鼠生长延迟天数,差异有显著性（P<0.05）,60分钟组,各数值均未见显著性差异（P>0.05）。结论99mTc-HL91乏氧显像是一种有效预测高压氧增敏效果的方法,且高压氧增敏作用随时间延长逐渐减弱。     

RAN基因沉默对辐射诱发基因组不稳定肝细胞HL-7702凋亡及细胞周期的影响

为研究RAN基因沉默对基因组不稳定肝细胞凋亡及细胞周期的影响,利用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术沉默基因组不稳定肝细胞中RAN基因的表达,通过流式细胞术检测RAN基因沉默后基因组不稳定肝细胞的凋亡率及细胞周期。实时荧光定量PCR检测表明,RAN siRNA能有效沉默RAN基因mRNA的转录(p0.01);流式细胞术检测表明,RAN基因沉默诱发基因组不稳定肝细胞G0/G1期细胞增加(p0.05),发生G1期阻滞,同时,细胞凋亡率较阴性对照组明显降低(p0.01)。说明RAN基因可能通过参与周期调控及促进细胞凋亡进而维持肝细胞基因组的稳定性。     

电离辐射诱导P21蛋白表达及对细胞周期解偶联的作用

采用免疫细胞化学方法检测P21蛋白表达的变化。采用P1荧光标记及流式细胞术（Flow cytometry,FCM）测定细胞周期并分析细胞倍体的变化。观察电离辐射对EL-4细胞P21蛋白表达的影响及对细胞周期解偶联的作用。时效实验结果显示,4．0GyX射线照射后2—72h,EL-4细胞中P21蛋白表达明显增高（p〈0．05-p〈0．001）。量效实验结果显示,0．5—6．0GyX射线照射后24h,EL-4细胞中P21蛋白表达明显增高（p〈0．01—p〈0．001）。结果还显示,1．0-16．0GyX射线照射后,EL-4细胞的8倍体细胞数在各剂量组均未见明显变化（均p〉0．05）。研究表明,电离辐射可诱导EL-4细胞P21蛋白表达,但不诱导EL-4细胞周期解偶联。提示P21蛋白可能参与细胞周期解偶联的分子调控。     

放疗后早期肿瘤组织内99Tcm-rh-Annexin Ⅴ分布与Survivin、Caspase-3蛋白表达的相关性研究

采用99Tcm-rh-AnnexinⅤ作为核素凋亡显像示踪剂,观察小鼠放疗后早期肿瘤组织内Survivin、Caspase-3蛋白表达。结果显示,放疗组肿瘤组织内99Tcm-rh-AnnexinⅤ分布、TUNEL检测阳性细胞数及Caspase-3蛋白表达均明显多于对照组,Survivin蛋白表达A组明显高于B组,差异均存在显著性（P均<0.01）。相关性研究表明,肿瘤组织的放射性摄取与TUNEL阳性细胞数呈明显正相关（r=0.942,P=0.000）;肿瘤组织内Survivin蛋白表达与Caspase-3蛋白表达呈明显负相关（r=-0.836,P=0.000）。肿瘤组织内99Tcm-Annexin Ⅴ分布与Caspase-3蛋白表达呈明显正相关（r=0.948,P=0.000）,与Survivin蛋白表达呈明显负相关（r=-0.819,P<0.01）。以上结果提示,肿瘤组织内99Tcm-rh-AnnexinⅤ的分布可以反映放疗后早期肿瘤组织细胞凋亡的状况以及凋亡调控蛋白Survivin、Caspase-3表达水平的变化。