丙种球蛋白四种抗体国家参考品的制备

<正> 根据WHO规程对丙种球蛋白制品(简称丙球)的要求,我所于1990年开始制备了一批可检测麻疹、白喉、乙肝(抗-HBs)和甲肝抗体(抗-HAV)的丙球抗体国家参考品。该参考品原料来自上海生物制品研究所的10％人丙半成品,经分装冻干后-30℃保存。其后,用WHO的抗麻疹血清、乙肝免疫球蛋白和甲肝免疫球蛋白国际标准品进行了丙球三种抗     

水痘—带状疱疹病毒IgG酶联检测试剂盒的研制和应用

目的 研制水痘IgG(VZV-IgG)酶联检测试剂盒。方法 将VZV接种二倍体细胞,收获病毒,经纯化后用作包被抗原;辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG制备酶联检测试剂盒并进行质量检定。结果 VZV-IgG酶联检测试剂盒敏感度与膜抗原荧光抗体法(FAMA)近似。结论 成功地制备了VZV-IgG酶联检测试剂盒。     

人巨细胞病毒IgM抗体生物素-亲和素单克隆抗体捕获时间分辨荧光免疫法检测试剂盒的研制与评价

目的建立人巨细胞病毒IgM(human cytomegalovirus IgM,HCMV IgM)抗体生物素-亲和素单克隆抗体捕获时间分辨荧光免疫法(biotin-avidin monoclonal antibody capture time-resolved fluoroimmunoassay,BA Mac TrFIA)检测试剂盒,并对其性能进行评价。方法采用鼠抗IgMμ链单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)作为固相反应板的包被抗体,生物素(biotin)标记的HCMV基因重组抗原作为桥接抗原,链酶亲和素(SA)标记铕(Eu3+)作为示踪物,配制以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的增强液,应用BA Mac TrFIA法进行HCMV IgM抗体的检测,对连续制备的3批试剂盒的最低检测限、重复性、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、热稳定性进行评价,并与巨细胞病毒IgM抗体诊断试剂盒同时对1 020份血清或血浆样本进行临床研究比对试验,采用Kappa检验进行一致性分析。结果选择4μg/ml作为鼠抗IgMμ链McAb最佳包被浓度,1∶10 000稀释作为HCMV-Bio最佳工作浓度,1∶1 500稀释作为SA-Eu3+最佳工作浓度,试剂盒参考值建议为阴性对照品检测荧光值(negative control counter,NCx)×2.1;连续制备的3批试剂盒最低检测限、重复性、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率均达到国家检定标准;于37℃恒温箱放置6 d后,检测性能无明显改变;临床研究比对试验Kappa指数为1,一致程度达100%。结论成功制备了HCMV IgM BA Mac TrFIA法检测试剂盒,该试剂盒灵敏度高,精密性较好,与同类产品检测结果相关性好,为临床HCMV lgM抗体的检测提供科学、可靠的诊断依据。     

献血员及人血丙球中丙型肝炎抗体筛检情况的分析

<正> 自1989年美国Choo和Kuo等开发了抗-HCV检测方法以来,丙型肝炎的诊断及防治研究进展十分迅速。我们用抗-HCV ELISA试剂盒抽检了HBsAg阴性的2,000余献血员抗-HCV水平,同时检测了本所生产的15批人血丙球制品及6批人血细胞γ-干扰素试制品的丙肝抗体,现将结果报告如下: 1.抽检了四川四个市县血站献血员2392人,抗-HCV阳性率3.09％(74/2392),其中乐山站3.66(22/601),都江堰站3.46％(23/664),中江站2.52％(11/437),仁寿站2.61％(18/690),各站间无显著差异(p>0.05)。与国内外有关抗-HCV阳性率资料比较,略     

呼吸道合胞病毒抗体效价3种检测方法的建立及比较

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)抗体效价的3种检测方法,并进行比较。方法棋盘滴定法优化ELISA法的包被抗原及酶标二抗的浓度,并检测该方法的线性范围及重复性;同时建立微量细胞中和试验法和蚀斑减少中和试验法,检测两种方法的重复性。用建立的3种方法及市售RSV抗体ELISA检测试剂盒同时检测55份健康人血清样本,并将两种ELISA法与两种中和抗体效价检测方法间的相关性进行两两比较。结果 ELISA法中包被抗原为10μg/ml及HRP标记的山羊抗人Ig G稀释度为1∶30 000时是最佳组合;在38.00~2.375 U/ml范围内,抗体浓度与A_(450/630)值呈良好线性关系,R~2=0.981 4;高、中、低3个浓度样本的变异系数(CV)均10%。微量细胞中和试验7 d后,细胞病变明显,细胞成片脱落;连续6次检测抗RSV多克隆抗体中和效价的CV值为4.2%。RSV感染Vero细胞7 d后出现明显的蚀斑形态,结晶紫染色后蚀斑边缘清晰;连续6次检测兔抗RSV抗血清效价的CV值为6.81%。本实验建立的ELISA法与市售ELISA试剂盒的相关系数(R)为0.787,微量细胞中和试验与蚀斑减少中和试验的R为0.937。结论成功建立了3种RSV抗体效价检测方法,本实验建立的ELISA法与市售ELISA试剂盒间及两种中和抗体检测方法间具有良好的相关性。     

破伤风抗体IgG酶联检测试剂盒的研制

目的 研制检测破伤风IgG的酶联检测试剂盒。方法 以精制破伤风类毒素进一步纯化后作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG作为抗体制备ELISA试剂盒,并进行敏感性、特异性及重复性检测。结果 试剂盒敏感性可达0.003 9 IU/ml,特异性达95％以上,重复性好,CV<7％,试剂盒置于37℃、7 d敏感性无明显改变。结论 成功地制备了破伤风抗体IgG酶联检测试剂盒。     

人α1微球蛋白ELISA检测试剂盒的制备及初步应用

目的制备人α1微球蛋白(alpha 1-microglobulin,α1-MG)ELISA定量检测试剂盒,并初步应用于临床标本的检测。方法用重组人α1-MG蛋白免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备特异性单克隆抗体,对单抗的特性进行鉴定后,采用双抗体夹心ELISA方法制备α1-MG试剂盒,并进行线性范围、灵敏度、准确性、精密性验证。应用制备的试剂盒检测100份健康人血清中的α1-MG含量,计算正常参考值;分别应用试剂盒及放射性免疫分析法(radioactive immunoassay,RIA)检测87份人血清标本,分析试剂盒与RIA法检测结果的相关性。结果经间接ELISA法筛选及克隆化培养,共获得4株稳定分泌抗α1-MG单抗的杂交瘤细胞株;制备的试剂盒最佳线性范围为0.5~60 mg/L,灵敏度为0.03 mg/L,检测不同浓度α1-MG的回收率在92.7%~97.1%之间,批内、批间变异系数(CV)分别为4.78%~8.57%和4.30%~6.84%;该试剂盒检测健康人血清样本中α1-MG含量正常参考值为15~32 mg/L,与RIA法的检测结果具有良好的相关性(r=0.958 6)。结论制备的人α1-MG ELISA检测试剂盒具有较高的准确性和灵敏度,且与RIA法具有良好的相关性,符合临床免疫分析的要求,适用于临床检测和科研应用。     

重组SARS-CoV-2蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒的研制

目的 制备重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒，并进行验证。方法 选用中国食品药品检定研究院(简称中检院)制备的羊抗S蛋白多克隆抗体作为包被抗体，从4株单克隆抗体(14C8、15F9、17A7和20D8)中筛选出1株具有受体结合域(receptor-binding domain,RBD)结合活性高，且广谱抗主要突变株的单克隆抗体作为酶标抗体(用HRP标记)，制备重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA法通用检测试剂盒，并采用棋盘滴定法对包被抗体稀释度(1∶125～1∶4 000)和酶标抗体稀释度(1∶250～1∶32 000)进行优化。验证试剂盒的专属性、线性范围、准确性、精密性及耐用性。将制备的通用检测试剂盒分发给12个实验室，检测各实验室自制的不同表达系统(CHO细胞、毕赤酵母、Sf9细胞或大肠埃希菌)和目的蛋白(RBD或S蛋白)的15批重组SARS-CoV-2蛋白疫苗原液(包括11批以WT株为参考序列设计的原液及4批以...     

高密度介质固相抗人球蛋白法检测孕妇ABO血型系统IgG抗体效价

目的探讨利用高密度介质固相抗人球蛋白法检测孕妇ABO血型系统IgG抗体效价的可行性。方法应用不完全抗体检测试剂盒(高密度介质固相抗人球蛋白法)检测40例O型血孕妇ABO血型系统IgG抗体效价,并与传统抗人球蛋白试管法进行对比。结果以IgG抗A(B)效价≥1:64定为阳性,两种方法的阳性检出率一致,均为50%(20/40);两种方法检测的抗体效价的几何均数差异无统计学意义(P>0.05);两种方法高度相关,r=0.9079(tr=13.36,P<0.001)。结论高密度介质固相抗人球蛋白法与传统抗人球蛋白试管法比较,操作简单,耗时短,结果准确,可应用于ABO血型系统IgG抗体效价的检测。     

西尼罗病毒抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及其应用

目的建立及验证西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)抗体间接ELISA检测方法,并用于评价疫苗的免疫效果。方法以纯化后的WNV E蛋白第三结构域(EDⅢ)蛋白作为包被抗原,建立WNV抗体间接ELISA检测方法,对抗原包被浓度(2.5、5、10、20、40、80μg/ml)、血清稀释度(1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320)、抗原封闭时间(0.5、1、1.5、2 h)、血清孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)、HRP标记的山羊抗马Ig G稀释倍数(1:5 000、1:10 000、1:20 000、1:40 000、1:80 000稀释)及其孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)进行优化,并验证该方法的特异性、敏感性及精密性。采用建立的方法检测WNV阴性马血清和病毒样颗粒(WNV-VLPs)疫苗免疫的马血清,与ALPHA公司试剂盒的检测结果进行比较。结果间接ELISA法最佳检测条件为:抗原包被浓度为20μg/ml,4℃包被过夜;Blocking ACE封闭液于37℃封闭1.5 h;加入血清(1:80稀释),37℃孵育1.5 h;加入HRP标记的山羊抗马Ig G(1:20 000稀释),37℃孵育1 h。该方法可特异性检测WNV阳性血清中的WNVE-Ig G抗体;阳性血清稀释至1:2 560时,检测结果仍为阳性;批内和批间的变异系数(CV)均小于7%。25份WNV阴性马血清检测结果均为WNVE-Ig G抗体阴性,经WNV-VLPs疫苗免疫的马血清中的WNVE-Ig G抗体效价水平随免疫次数的增加呈递增趋势,间接ELISA法与ALPHA公司试剂盒的检测结果完全一致。结论成功建立了WNV抗体间接ELISA检测方法,可用于疫苗免疫效果的评价,为开展WNV流行病学调查、诊断及新型疫苗的研发奠定了基础。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(gE)的双抗体夹心ELISA检测方法，并进行验证。方法 以VZV全病毒抗原为免疫原，通过小鼠杂交瘤融合技术筛选可稳定分泌抗VZV-g E抗体的杂交瘤细胞株，间接ELISA法检测小鼠腹水抗体效价，经Hi Trap^TMMabselect^TMSu Re和Hi Trap^TMDesalting纯化后，12%SDS-PAGE分析单克隆抗体纯度，Western blot法检测特异性，小鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定亚型。经表位叠加试验筛选捕获抗体及酶标抗体，棋盘滴定法确定捕获抗体(0.25、0.5、1、2、5和10μg/m L)和酶标抗体(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000和1∶10 000稀释)工作浓度后，建立VZV-g E含量的双抗体夹心ELISA检测方法。验证方法的线性范围、准确性、精密性和特异性。采用建立的方法检测3批7 L生物反应器培养1～14 d的CHO-VZV-g E细胞培养上清中g E含量。结果共获得4株稳...     

血管内皮生长因子化学发光免疫测定试剂盒的研制及验证

目的研制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)化学发光免疫测定试剂盒,并对该试剂盒进行验证。方法以试剂盒的技术指标和血清检测结果为参考依据,建立检测方法,确定检测范围,并对包被抗体(1∶500、1∶1 000和1∶2 000倍稀释)及酶标抗体浓度(1∶3 000、1∶5 000、1∶6 000和1∶8 000倍稀释)、包被温度(室温和4℃)、封闭液成分(1%小牛血清、1%和0.5%牛血清白蛋白)及干燥方法(超净台吹干和使用真空干燥机进行干燥)进行优化;同时对试剂盒的线性、检出限、精密性、准确度、特异性及热稳定性进行验证;采用本试剂盒对139例非肿瘤人群和100例肿瘤患者的血清样本进行初步检测。结果方法的最佳检测条件为:包被抗体浓度为1∶1 000,酶标抗体浓度为1∶3 000,对血清样本的检测范围为6.25~800 pg/ml,最佳包被浓度为4℃,最佳封闭液成分为0.5%牛血清白蛋白,最佳干燥方法为真空干燥法。试剂盒线性相关系数r0.99,校准曲线各点偏差的绝对值10%,最低检出限≤3.125 pg/ml,空白检出限≤3.125 pg/ml,批内差异5%,批间差异7%,回收率为85%~99%;特异性检验结果为本试剂盒对EGF、FGF-2、PDGF-AA、Pl GF-1、Pl GF-2、HGF、TNF-α、TNF-β检测的交叉反应率≤0.52%;经37℃保存3、7 d后,试剂盒线性相关系数r0.99,空白检出限≤3.125 pg/ml,批内差异8%,回收率为80%~82%。139例非肿瘤人群和100例肿瘤患者的血清样本中VEGF的中位水平(M)分别为44.6和83.4 pg/ml。结论本研究开发的试剂盒具有较高的准确性、灵敏性、特异性,适用于血清VEGF的临床检测,具有较好的临床应用前景。     

破伤风抗体胶体金检测试剂盒的研制

目的 研制破伤风抗体胶体金检测试剂盒。方法 应用胶体金免疫斑点法研制破伤风抗体胶体金检测试剂盒,并对破伤风类毒素免疫的豚鼠及人血清的破伤风抗体水平进行测定。结果 该试剂盒所测定的结果与小鼠体内法的相关性好(r>0.95,P=0.25),远优于目前使用的间接血凝法(r<0.10);且该试剂盒的灵敏度较小鼠法高1倍,特异性强,无交叉反应,精密准确。结论 可用于临床检测患者创伤后的血清破伤风抗体水平。     

静注人免疫球蛋白制剂抗巨细胞病毒中和抗体效价的筛查

目的筛查国内、外静注人免疫球蛋白(human intravenous immunoglobulin,IVIG)和静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(human intravenous cytomegalovirus immunoglobulin,CMV-IVIG)制品抗CMV中和抗体效价。方法采用微量细胞病变法检测国内、外IVIG制品及CMV-IVIG抗CMV中和抗体效价,并进行比较。结果国外CMV-IVIG制品Cytogam(3 648 U/g IgG)和Cytotect(3 104 U/g IgG)抗CMV中和抗体效价分别是IVIG制品Privigen(1 048 U/g IgG)和Intratect(980 U/g IgG)的3.5和3.2倍;国内CMV-IVIG制品抗CMV中和抗体平均效价(7 195 U/g IgG)是国内13家企业19批IVIG制品(1 836 U/g IgG)的3.9倍;国内IVIG制品抗CMV中和抗体平均效价是国外IVIG制品Privigen和Intratect的1.8和1.9倍,国内CMV-IVIG制品抗CMV中和抗体平均效价是国外CMV-IVIG制品Cytogam和Cytotect的2.0和2.3倍。结论国内、外的CMV-IVIG制品抗CMV中和抗体效价均为相应IVIG制品3倍以上,采用微量细胞病变法筛查血浆用于制备CMV-IVIG具有可行性,为CMV相关疾病的被动免疫制剂的制备提供了实验依据。     

抗-HCV多表位抗体在检测HCV抗原中的应用

目的应用丙型肝炎病毒多表位抗体,探索从血浆或血清样品中检测丙型肝炎病毒抗原(HCAg)的可能性,为献血员筛选及临床早期诊断提供检测方法。方法利用原核系统表达的丙型肝炎病毒(HCV)7个高度保守区基因的多表位复合抗原免疫动物,制备抗-HCV多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测血浆或血清中的HCAg,并与RT-PCR法进行比较。结果制备的抗-HCV多表位复合抗原多克隆抗体,在用ELISA法检测HCAg中表现出较高的特异性及灵敏性,Cutoff值为0·239,批内CV值为5·60%~6·65%,批间CV值为7·80%。与RT-PCR比较,相关系数为0·816,灵敏度为88·89%,特异度为96·30%,一致性为95·24%,调整一致性为90·82%,阳性预测值为80·00%,阴性预测值为98·11%。HCAg检出率与美国ORTHO公司HCV-C抗原检测试剂盒差异无显著意义(P=0·06)。结论用HCV多表位复合抗原制备的多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测HCAg,具有灵敏、特异、快速的优点,有望开发成为HCAg诊断试剂盒。     

灭活轮状病毒疫苗与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗联合使用免疫效果评价

目的评价灭活轮状病毒疫苗(inactivated rotavirus vaccine,IRV)与灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(inactivated poliovirus vaccine,IPV)免疫大鼠后,两种疫苗间免疫效果的相互作用。方法将Wistar大鼠随机分成联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组:联合免疫组接种IPV后4周,经双侧腿同时免疫IPV和IRV,共2次,间隔4周;单疫苗免疫组2组,分别免疫3针IPV和2针IRV,每针均间隔4周;间隔免疫组免疫1针IPV后4周,开始进行IPV和IRV间隔免疫(每针间隔2周,共6周)。分别于每次免疫后4周经尾静脉采血,分离血清,采用微量中和试验结合免疫荧光抑制方法检测血清抗RV中和抗体水平,ELISA法检测血清抗RV特异性Ig G抗体水平,微量中和试验法检测血清抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平。结果大鼠经2针IRV免疫后,血清抗RV中和抗体和特异性Ig G抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)均明显上升,血清抗体阳转率均达100%;经3针IPV免疫后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体GMT均明显上升,抗体阳转率均达100%;联合免疫组、间隔免疫组和单疫苗免疫组间血清抗RV中和抗体水平、特异性Ig G抗体水平及抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IRV和IPV免疫大鼠后均获得到良好的免疫效果,两种疫苗联合使用时,免疫效果无相互干扰作用。     

病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒的适用性验证

目的对病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒进行适用性验证。方法将不同细胞基质制备的乙型脑炎灭活疫苗、人用狂犬病病毒疫苗共16批编盲后,每批疫苗均质等量分为44份,分别分发给3个实验室,用同批ELISA-Vero细胞宿主蛋白检测试剂盒进行检测,对试剂盒进行适用性验证,考核试剂盒的专属性、精密性、线性和范围等指标。结果3个实验室检测每批样品44次,原代地鼠肾细胞和鸡胚细胞为基质的疫苗检测结果均为阴性,以Vero细胞为基质的疫苗检测结果均为阳性。16份样本44次检测结果的变异系数在7.34%～14.77%之间,均低于15%;相对线性范围在12.5～400 ng/ml之间。16份疫苗中6批Vero细胞乙脑疫苗和5批人用狂犬病病毒疫苗检出的细胞宿主蛋白残留量分别在153.3～5 850.9 ng/ml和1 895.7~40 625.1 ng/ml之间。结论疫苗中Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒具有较好的专属性、精密性和线性,可用于Vero细胞为基质的病毒类疫苗宿主蛋白残留量的检测。     

两种方法检测人血清中抗水痘抗体的比较

水痘-带状疱疹病毒(VZV)抗体检测的方法主要有膜抗原免疫荧光抗体检测试验(FAMA)和EIJSA等。FAMA是传统的“金标准”，但操作繁琐，时间较长，ELISA简便易行，可自动化操作，时间短，适于大规模筛选样本。目前市售ELISA试剂盒均采用全病毒抗原包被，敏感性较差，只有个别疫苗制造公司开发了糖蛋白ELISA(gpELISA)试剂盒，但尚未商业化。     

细胞核染色法检测人免疫球蛋白类制品巨细胞病毒中和抗体效价

目的检测静注免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)(p H 4)及巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)免疫球蛋白(IG)中的CMV中和抗体效价。方法采用基于微量细胞病变的细胞核染色法检测39批国产IVIG、8批注册检验巨细胞病毒免疫球蛋白(CMV-IG)以及2批国外CMV-IG制品的CMV中和抗体效价。结果 39批IVIG的CMV中和抗体效价几何平均值为361 U/ml,最低效价为234 U/ml,最高效价为502 U/ml;8批注册检验CMV-IG的CMV中和抗体效价几何平均值为1 113 U/ml,最低效价为923 U/ml,最高效价为1 553 U/ml;2批国外CMVIG的CMV抗体效价分别为579 U/ml和163 U/m。8批注册检验CMV-IG的CMV中和抗体效价显著高于39批IVIG的CMV中和抗体效价(P0.001)。结论国产39批IVIG的CMV中和抗体效价在234~502 U/ml之间,经血浆筛查后投浆制备的CMV-IG显著高于普通IVIG的CMV中和抗体效价。     

抗环瓜氨酸肽抗体定量检测ELISA试剂盒的制备及其诊断类风湿性关节炎的意义

目的制备抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体定量检测ELISA试剂盒,并探讨其诊断类风湿性关节炎(RA)的意义。方法应用作者合成的CCP制备抗CCP抗体定量检测试剂盒,并进行鉴定。应用该试剂盒检测178份RA患者和712份非RA患者及健康人血清,评价其在RA诊断中的价值。结果所制备的定量检测试剂盒cutoff值为25RU/ml;线性良好,R2值大于0.99;试验内变异系数为5.15%~8.25%,试验间变异系数为6.82%~11.23%;平均回收率为99.7%。该试剂盒在4℃保存6个月,稳定性良好。与国外同类试剂盒同时测定80份样本,阳性符合率为95.7%,阴性符合率为97.1%,总体符合率为96.3%。该试剂盒对RA诊断的敏感性为73.0%,特异性为98.2%。结论所制备的试剂盒各项指标均达到相关要求,能够满足临床检测的需要。