食源性MRSA氨基糖苷类耐药基因多重PCR方法建立

目的:了解食源性金黄色葡萄球菌中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)及对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素抗生素的耐药性情况,并建立快速检测鉴定金黄色葡萄球菌耐药性多重PCR方法。方法:对金黄色葡萄球菌进行增菌培养,并提取DNA作为模板,以nuc基因作为菌属鉴定基因,mec A基因作为MRSA检测基因,aac A-aph D及aph(3')-Ⅲa基因作为耐氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素的检测目的基因,建立四重PCR检测方法并进行特异性及灵敏度评价;利用所建立的方法检测72株食品及食物中毒患者来源的金黄色葡萄球菌。结果:成功建立四重PCR检测方法,且72株金黄色葡萄球菌均有nuc基因检出,mec A基因与MRSA检测符合率达100%,aac A-aph D、aph(3')-Ⅲa基因与庆大霉素、卡那霉素耐药菌株的符合率达95.12%。结论:本实验所建立的多重PCR方法灵敏度高、特异性好,可以快速检测出MRSA,并对氨基糖苷类庆大霉素、卡那霉素耐药菌株检测具有较高的准确率。     

食源性金黄色葡萄球菌青霉素类药物耐药基因型的分析

目的 建立多重PCR方法检测青霉素酶基因和mecA基因,了解食源性金黄色葡萄球菌两种β-内酰胺类药物耐药基因的分布情况,为金黄色葡萄球菌引起食源性疾病的防治提供参考数据.方法 建立多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌青霉素酶基因、mecA基因和16S rDNA;多重PCR方法测定食品来源的171株金黄色葡萄球菌对青霉素类药物的耐药基因型.结果 165株菌携带有青霉素酶基因(96.5％),9株菌携带有mecA基因(5.3％).结论 建立的多重PCR检测方法快速、简便、准确,可满足高通量筛选菌株的需求;食源性金黄色葡萄球菌具有很高的青霉素酶基因携带率,并存在耐甲氧西林的菌株.     

金黄色葡萄球菌耐药性与生物被膜能力的鉴定

本文选择常见的典型食源性微生物金黄色葡萄球菌,从食品微生物安全角度出发,对127株葡萄球菌的菌株特性、耐药性与生物被膜生长能力进行研究,包括菌株生化鉴定;PCR扩增葡萄球菌特异16S rRNA与金葡菌特异femA基因,通过对耐药基因mecA和orfX检测确定菌株的耐药特性;最后,运用结晶紫染色法进行生物被膜能力检测。127株菌株包括119株金葡菌(均携带16S rRNA与femA)与8株凝固酶阴性葡萄球菌8株(仅携带16S rRNA)。119株金葡菌中,107株携带mecA基因与orfX基因,为耐甲氧西林金葡球菌(MRSA);8株凝固酶阴性葡萄球菌中,均携带mecA基因。所有菌株均能生成生物被膜,其中能形成强、中等与弱粘附生物被膜能力菌株分别有5(3.9%)、47(37.0%)和75(59.1%)株。金葡菌中耐药性与生物被膜较为普遍,由于食源性微生物形成生物被膜后,具有逃逸常规消毒和杀菌手段的能力,成为食品安全中的潜在隐患。     

现制饮品中金黄色葡萄球菌耐药及遗传特征研究

目的 探究我国现制饮品中金黄色葡萄球菌抗生素耐药及遗传特征。方法 采用微量肉汤稀释法对金黄色葡萄球菌进行药敏测定,同时提取菌株基因组DNA进行全基因组测序,并使用生物信息学分析流程进行基因组特征数据挖掘。结果 现制饮品中43株金黄色葡萄球菌对10种抗生素的总体耐药率为88.4%,分属9种耐药谱,其中3株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）。多重耐药菌（Multidrug resistant,MDR）占比16.3%,主要为含乳现制饮品。耐受7类及以上抗生素金黄色葡萄球菌3株,其中1株为MRSA。全基因测序进化分析表明菌株耐药表型与基因型具有良好的相关性,MRSA及多重耐药株出现明显聚集。43株菌属于16种多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）,其中MRSA菌株包括1株ST45型和2株ST398型。多重耐药株ST型别为ST5、7、15、59、121和398型。多重耐药MRSA株为ST398型。金葡肠毒素基因整体携带率为34.9%,其中sea为主要基因型。MRSA菌株均不携带毒力基因,多重耐药株肠毒素基因携带率为42.9%。3株主要来自含水果类现制饮品的ST1型菌株同时携带6种肠毒素基因,但其仅对青霉素耐药或为敏感株。结论 我国现制饮品中金黄色葡萄球菌存在MRSA及多重耐药菌,且该类菌株在遗传进化中聚类明显,虽然MRSA菌株致病性相对较弱,然而MDR菌株肠毒素基因的高携带率提示耐药金黄色葡萄球菌的潜在危害不容忽视。因此,应加强现制饮品中金黄色葡萄球菌的耐药监测与防控。     

金黄色葡萄球菌生物被膜基因型的分子鉴定

本文选用常见的典型食源性微生物金黄色葡萄球菌,从食品微生物安全角度出发,采用生物被膜菌落结晶紫染色法定量检测58株金黄色葡萄球菌菌株生物被膜的形成能力。并对金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因型进行分型研究,包括ica调控子分型(ica A、ica D、ica BC)与粘附特性分型(agr、atl E和aap)研究。结果显示,所有检测菌株均能生成生物被膜,其中3株能生成强粘附性生物被膜,占5.2%;生成中等生物被膜能力菌株有23株,占39.7%;32株金黄色葡萄球菌生成弱粘附生物被膜,占55.2%。实验所用的58株菌株中有48株能扩增出ica A基因,56株扩增出ica D基因,57株扩增出ica BC基因,56株扩增出agr,分别有53株和57株染色体中存在aap和atl E基因。本实验的结论:ica操纵子为金黄色葡萄球菌生物被膜形成所必须,aap基因可能作为促进金黄色葡萄球菌生物被膜形成的一个独立因素。而atl E,agr基因是金黄色葡萄球菌生物被膜粘附过程中形成所必须的调节因子。     

广东地区46株食源性金黄色葡萄球菌耐药性、生物被膜形成能力及IcaAB基因的特征分析

目的 分析广东地区食源性金黄色葡萄球菌耐药现状、生物被膜形成能力及生物被膜相关基因IcaAB的特征。方法 对46株食源性金黄色葡萄球菌采用微量肉汤稀释法进行药敏实验,采用结晶紫法检测生物被膜生成能力,运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测生物被膜相关基因。结果 97.83%的菌株对至少1种抗生素耐药, 30.43%为多重耐药菌株,对青霉素(97.83%)、氨苄西林(97.83%)耐药性最高; 65.22%菌株能够形成生物被膜,其中强、中和弱粘附生物被膜能力的菌株分别占17.39%、30.43%和17.39%,且产生物被膜能力强的菌株对特定抗生素(头孢西丁、环丙沙星)的耐药性更高(P<0.05); PCR结果显示, icaA、icaB的检出率分别为56.67%、36.67%,基因携带率与产膜能力无显著关联(P>0.05)。结论 广东地区食源性金黄色葡萄球菌普遍表现出耐药性和生物被膜形成能力,对公共卫生带来挑战,需采用措施以确保公共安全。     

食源性MRSA双色荧光PCR检测方法建立

目的建立快速检测食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)Taqman探针双色荧光PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌种属鉴定nuc基因和MRSA决定因子mec A基因,设计合成引物探针,建立双色荧光PCR扩增体系。利用所建立的方法检测特异性及灵敏度。将金黄色葡萄球菌依次传代培养,检测不同代次的菌株验证方法的稳定性,并对实际样品分离株进行检测验证方法的可行性与实用性。结果该方法可准确并特异性检测出MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA),检测MRSA的nuc基因和mec A基因的灵敏度可达2.7×103 CFU/m L,不同代次的菌株的检测结果一致。结论本实验所建立的双色荧光PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度及稳定性,可用于快速检测食源性MRSA。     

苏州市食源性金黄色葡萄球菌耐药分析及基因分型

目的 对苏州市2014~2017年分离的食源性金黄色葡萄球菌进行耐药谱和分子分型分析, 初步建立PFGE(pulsed-field gel electrophoresis)分型数据库。方法 采用微量肉汤稀释法检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SAU)对19种常用的抗生素的耐药性, 采用Sma I进行酶切, 脉冲场凝胶电泳进行分子分型。菌株指纹图谱用BioNumerics v6.6软件进行分析。结果 81株SAU中检出10株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistance Staphylococcus aureus, MRSA), 检出率12.3%。有72株菌存在不同程度的耐药, 耐药率达到88.9%, 其中对青霉素的耐药率最高(82.7%), 其次是氨苄西林(66.7%), 其后是克林霉素和红霉素(均为50.6%)。耐受3种和3种以上药物的多重耐药菌株共38株, 多重耐药率达46.9%。MRSA的多重耐药率高于甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA), 差异具有统计学意义(P<0.05)。除8株菌不可被PFGE分型外, 其余73株菌可以被分为37个不同型别, 其中有4个优势型别共27株菌, 在可分型菌株中占比达37.0%。这些同源菌株分离自不同时间和地点, 有些还存在一定程度的变异。结论 食源性金黄色葡萄球菌耐药现象普遍存在, 多重耐药率较高, PFGE型别较为多样但有优势型别存在, 耐药谱和PFGE型别关联性较差。     

北京市食源性金黄色葡萄球菌耐药及分子分型研究

分析北京市食源性金黄色葡萄球菌对常用抗生素的耐药情况及其分子分型特征,预防和控制由该菌引起的食源性疾病,为临床合理用药提供依据。方法 收集2010—2012年北京地区食源性致病菌监测网分离到的金黄色葡萄球菌187株,采用微量肉汤稀释法检测金黄色葡萄球菌对8种常用抗生素的敏感性。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型。结果 116株金黄色葡萄球菌表现出对抗生素耐药,耐药率为62.03%,对抗生素的耐药率为红霉素(ERY)45.45%、苯唑西林(OXA)27.81%、克林霉素(CLI)20.86%、四环素(TET)13.90%、氯霉素(CHL)11.76%、环丙沙星(CIP)6.42%、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(TPM/SMZ)5.88%。其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)52株、对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)135株。分离到的MRSA中34株菌表现出多重耐药。全部菌株共分为129种PFGE带型,优势带型不明显。结论 食源性金黄色葡萄球菌的耐药和多重耐药普遍存在,PFGE带型分布分散与耐药谱的关联性较差。     

生猪养殖场环境及屠宰加工环节金黄色葡萄球菌污染及耐药谱状况

为了探究养殖及流通环节金黄色葡萄球菌污染及其耐药状况,采集某养殖场环境,屠宰加工环节及某市场生猪肉等507份样本。根据国标GB 4789.10-2010分离金黄色葡萄球菌136株;纸片扩散法、E-test法检测分离菌株耐药谱;聚合酶链式反应(PCR)检测所有菌株携带四环素、大环内酯类、林可酰胺类耐药基因及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicilin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)特异性基因mec A与mec C(即mec ALGA251)状况。结果表明,来自屠宰场生猪肉样本金黄色葡萄球菌污染率达44.11%(60/136),与其它来源的分离率相比有显著性差异(P0.05);对临床用于治疗金黄色葡萄球菌感染的青霉素、四环素及克林霉素耐药率分别为92.64%(126/136)、56.61%(77/136)、50.00%(58/136);多重耐药达56.62%(77/136);耐药谱以CIP/P/CN/TE/CLR/SXT/DA,P/CLR/DA,CIP/P/TE/CLR/C/SXT/RD/DA为主;金黄色葡萄球菌携带耐药基因较为严重,其中耐四环素基因tet K检测率为最高,达90.44%。研究结果为控制多重耐药金黄色葡萄球菌随食物链的传播的提供科学依据。     

Occurrence and characteristics of methicillin-resistant and -susceptible Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci from Japanese retail ready-to-eat raw fish

Staphylococci are not part of the normal fish microflora. The presence of staphylococci on fish is an indication of (a) post-harvest contamination due to poor personnel hygiene, or (b) disease in fish. The aim of this study was to determine the prevalence, molecular genetic characteristics, antibiotic resistance and virulence factors of methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (MSSA), methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci (MR-CoNS) isolated from 200 samples of retail ready-to-eat raw fish (sashimi) collected from the Japanese prefecture of Hiroshima. We characterized 180 staphylococcal strains. A majority of the grocery stores surveyed (92%, 23/25) contained fish contaminated with Staphylococcus species. We recovered 175 S. aureus isolates from 174 (87%, 174/200) samples, with 170 isolates of MSSA. For the MRSA and MR-CoNS, 10 isolates were obtained from 10 samples (5%, 10/200) collected from 10 shops (40%, 10/25) belonging to four supermarket chains. SCCmec typing revealed the presence of a type IV.1 SCCmec cassette in S. warneri isolates, a type II.1 SCCmec cassette in S. haemolyticus isolates and a cassette in methicillin-resistant S. aureus (MRSA) isolates that could not be typed. Molecular typing of two MRSA isolates by spa sequencing and multilocus sequence typing (MLST) identified t1767 and ST8, respectively. Antibiotic resistance genes that confer resistance to aminoglycosides, tetracyclines, β-lactams, macrolides, lincosamides and streptogramin B (MLS(B)) antibiotics were detected. Genes encoding one or more of the following virulence factors: staphylococcal enterotoxins (seb, and sed), toxic shock syndrome toxin 1 (tst), exfoliative toxin (etaA) were detected in 14.2% (25/175) of S. aureus isolates. The accessory gene regulator (agr) typing of S. aureus isolates revealed that agr type 1 was most prevalent (96.5%, 169/175) followed by type 2 (2.2%, 4/175) and type 3 (1.1%, 2/175). None of the S. aureus isolates carried the Panton-Valentine leucocidin (PVL) encoding genes, lukF-PV and lukS-PV. To the best of our knowledge, this is the first report to show MRSA and MR-CoNS isolated from retail ready-to-eat food in Japan. Our results showed that sashimi is a likely vehicle for transmission of multidrug-resistant and toxigenic staphylococci.     

2009—2020年北京市朝阳区113株食源性金黄色葡萄球菌耐甲氧西林和肠毒素/类肠毒素基因携带与分子分型分析

目的 了解北京市朝阳区2009—2020年113株食源性金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药、肠毒素/类肠毒素基因携带和分子分型情况.方法 采用纸片扩散法进行头孢西丁药物敏感性实验,结合mecA基因扩增鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)...     

黑龙江耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药及分子分型研究

目的了解黑龙江省健康人与屠宰场猪耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)携带情况,及其耐药和分子分型情况。方法参照黑龙江省金黄色葡萄球菌专项监测方案,对分离的金黄色葡萄球菌进行药物敏感性检测筛选MRSA,对MRSA进行spa、MLST和SCCmec基因分型,同时检测pvl基因。结果 1500份健康人样本分离出257株金黄色葡萄球菌(17.13%, 257/1500), 500份猪样本分离出149株金黄色葡萄球菌(29.8%, 149/500)。所有菌株对万古霉素、替考拉宁和利奈唑烷均敏感,对红霉素和克林霉素耐药率较高。MLST分型结果为ST9型, 1株未鉴定出型别。spa分型为t899和t2922, t899为主要型别(83%, 29/35)。SCCmec分型结果为IVb型, pvl基因均为阴性。结论黑龙江省健康人MRSA携带率比例较低,屠宰场猪携带一定程度MRSA,且猪源金黄色葡萄球菌耐药情况较重,应控制养殖动物抗生素的使用。     

2016年广州市市售食品中食源性致病菌 监测结果分析

目的 了解广州市市售食品中食源性致病菌污染及分布情况, 发现危险因素。方法 2016年共采集6类共1058份食品样品, 对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特氏菌等进行监测分析。结果 检出食源性致病菌164株, 总检出率为15.50%。食源性致病菌中副溶血性弧菌的检出率最高(40.93%), 其次为蜡样芽胞杆菌(9.29%)、金黄色葡萄球菌(2.38%)、单增李斯特氏菌(2.08%)、沙门氏菌(1.42%), 致泻大肠埃希氏菌检出率为0。不同食品类别中水产品检出率最高, 达到了43.52%, 其次为烘焙食品(13.64%)、小摊贩食品(10.62%)、生鸡肉(8.47%)、冷藏膳食(7.50%)和熟肉制品(6.82%), 不同食品食源性致病菌检出率差异有统计学意义。不同采样场所中采自餐饮店的食品食源性致病菌检出率最高(50.00%), 其次是农贸肉菜市场(17.70%)、超市(16.71%)和小摊贩(10.62%), 最低的是零售店(9.83%)。散装食品食源性致病菌检出率(15.85%)高于预包装食品的检出率(9.09%)。中心城区烘焙食品、生鸡肉致病菌检出率要高于周边区, 周边区域小摊贩食品致病菌检出率为零。结论 2016年广州市市售食品存在较高的食源性致病菌检出率, 对食品安全隐患较高的食品应加强监管, 预防和控制食源性疾病的发生。     

南京部分地区食品中金黄色葡萄球菌污染状况调查

目的了解南京市市场出售的食品中金黄色葡萄球菌污染情况,为预防和控制食源性疾病的发生提供依据。方法 2016年11月~2017年5月从南京市浦口区、建邺区、鼓楼区以及玄武区的各大超市,农贸市场以及牧场采集132份食品样品。按照GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》方法进行检验,并使用荧光定量PCR方法对所得结果进行验证。结果 5类132份食品样品中均未检出金黄色葡萄球菌,但出现可疑菌落率最高的食品种类为普通生肉及调味肉,其次为豆制品;针对不同地区同一种类的样品,农贸市场抽检食品中可疑菌落的发现率最高,从不同抽检时间来看,可疑菌落检出率最高出现在2017年第二季度。结论南京市市售食品中未检出金黄色葡萄球菌,表明从业人员的食品卫生意识正逐步提高,但仍需要加强食品卫生安全监管,进一步预防食源性疾病的发生。     

Beef carcass contamination in a slaughterhouse and prevalence of resistance to antimicrobial drugs in isolates of selected microbial species

Meat contaminating bacteria may be the direct cause of foodborne diseases and represent a potential cause for the drug resistance of human pathogenic agents. The prevalence and resistance to 17 antimicrobial drugs of isolates of selected bacterial species were investigated in 70 swabs of beef carcasses and 70 subsequent samples of beef meat. Molecular techniques (coagulase gene typing Staphylococcus aureus and original gene typing Escherichia coli) were used in the differentiation of isolates. Carcasses were already contaminated after evisceration, least frequently with S. aureus strains (7.5% of samples), most frequently with coagulase-negative staphylococci strains (52.2% of samples). During carcass processing, contamination with resistant or polyresistant strains of S. aureus and E. coli significantly increased (P<0.01). Gene typing isolates of S. aureus and E. coli indicated that the strains probably originated in the processing plant.     

Emergence and characterization of foodborne methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Korea

A total of 165 Staphylococcus aureus strains, isolated from different food samples between 2003 and 2006, were tested for antimicrobial susceptibility. The mecA-positive methicillin-resistant S. aureus (MRSA) strains were further characterized by testing for various virulence genes and by molecular typing with multilocus sequence typing and pulsed-field gel electrophoresis. Of the 165 S. aureus isolates, 150 strains (90.9%) were resistant to at least one antibiotic while no strain was resistant to vancomycin. Four strains were resistant to both oxacillin and cefoxitin and were mecA positive. The mecA-positive MRSA strains were isolated from raw meat and fish samples (two beef samples and two fish samples) and were resistant to β-lactam antibiotics. Based on multilocus sequence typing analysis, the isolates were assigned to sequence type 1 (ST1), ST72, and an undetermined ST (ST72 slv). All four MRSA isolates were shown to be enterotoxigenic. The ST1 MRSA isolate harbored the sea-seh gene combination and the ST72 and ST72 slv MRSA strains harbored the seg-sei and the sea-seg-sei gene combinations, respectively. However, none of the MRSA isolates had the genes for Panton-Valentine leukocidin, toxic shock syndrome toxin 1, and exfoliative toxins. The pulsed-field gel electrophoresis patterns of the ST72 isolates in our study were highly similar, even though they were isolated from food samples in different years and from different regions of Korea.     

四川省动物性食品中金黄色葡萄球菌的分离鉴定及污染分析

目的：为分析四川省动物性食品源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称SA)的耐药性,收集菌株,同时分析动物性食品中SA的污染情况。方法：本实验自2006年12月至2007年9月从四川省各地采集猪源、牛源、鸡源动物性食品样品共2560份,利用选择性培养基和生化实验等常规方法分离鉴定SA。结果：用Baird-Parker平板初步筛出疑似SA 118株,结合国标中规定的涂片染色镜检,溶血现象和血浆凝固酶实验结果,判定SA 有108株,而科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板和TH-16S中的双歧索引鉴定结果均判定SA有 113株;依据TH-16S中的16项生化实验结果,118株疑似SA仅有64%(76株)的菌株鉴定为SA。依据国标判定结果,2560份样品中SA的分离率为4.21%,其中生牛奶中SA的分离率最高(10.54%),其次是猪肉(7.11%),鲜鸡蛋中SA的分离率为零。结论：四川地区动物性食品源SA的生化表型复杂且存在一定差异,常规的表型分析具有一定缺陷。各个地方各类样品中SA污染情况有一定差异,与其他报道相比,四川省生肉、生奶和鲜蛋中SA的分离率较低。     

金黄色葡萄球菌肠毒素与多位点序列分型分子分型研究进展

金黄色葡萄球菌是引起临床疾病、社区感染和食物中毒的常见革兰氏阳性菌;肠毒素是参与金黄色葡萄球菌引起食物中毒、猩红热、全身感染等疾病的重要毒力因子;目前已发现27种金黄色葡萄球菌肠毒素/类肠毒素,不同来源金黄色葡萄球菌携带肠毒素/类肠毒素存在差异;多位点序列分型(MLST) 是一门新兴的基于细菌多个管家基因位点差异性分析、可长期监测细菌遗传进化趋势的分子分型技术;截至2021年初MLST已建立128种细菌的分型数据库,金黄色葡萄球菌数据库中已有6583种分型,金黄色葡萄球菌ST分型存在明显的地区流行性,各地已形成独特优势克隆。目前研究表明金黄色葡萄球菌肠毒素/类肠毒素携带与MLST分型间存在一定的相关性,本文将围绕金黄色葡萄球菌肠毒素/类肠毒素、MLST分型及相关性进行综述。